使基因表达靶向于神经胶质瘤的核酸分子和方法技术

本发明专利技术提供一种核酸分子，其包含一个神经胶质特异性的启动子；一段转基因编码序列；和多个miRNA靶位点。每个miRNA靶位点均结合一个在神经胶质瘤细胞中相比于在正常神经胶质细胞中下调的miRNA，并且所述神经胶质特异性启动子和所述多个miRNA靶位点均可操作地连接于所述转基因编码序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术主要涉及使基因表达定向到神经胶质瘤中的核酸分子、表达载体和方法。
技术介绍
选择的细胞或组织类型中的特异性基因表达可通过使用与配体结合的递送载体 的靶向基因递送实现，所述递送载体通过所述配体结合于靶细胞独特的细胞表面受体。特 异性基因表达还可通过使用细胞特异性启动子和增强子的靶向转录实现。细胞特异性启动 子是将特殊细胞功能限制于特定分化细胞类型的主要方式之一。这些启动子指导相关基因 转录的能力通过特定类型细胞中转录因子的胞内浓度和活性调节。使用细胞特异性细胞启动子以将转基因表达限制在靶组织中的细胞类型特异性 转基因表达是一种可用于生物学研究以研究基因的细胞功能的技术，并且是一种可用于医 学用途以消除由治疗基因的脱靶表达导致的副作用的技术。目前，采用组织或细胞类型特异性启动子来控制转基因表达的特异性。此方法对 于在癌症治疗中表达自杀基因尤其有吸引力，所述癌症治疗使用毒性基因或编码使前药转 变为毒性化合物的酶的基因。前人在自杀基因的表达中使用组织或细胞特异性启动子或者肿瘤选择性启动子 的努力取得了利弊并存的成功，遭受到这些启动子将治疗基因表达严密限制于肿瘤细胞的 严密性的困扰(Harrington et al,2000 ；Robson&Hirst, 2003 ；Saukkonen and Hemminki, 2005)。这与以下观念一致定义组织特异性并不简单，因为人基因组的转录普遍存在(Yang et al. ,2005 ；Birney et al.，2007)。而且，组织特异性基因在不同的生理条件下可能不是 真正特异性的，并且细胞启动子可因内源性顺式和反式调节元件在不同生理条件下的不同 表达而呈现不同的诱导模式(Harrington et al,2000 ；Robson&Hirst, 2003 ；Saukkonenand Hemminki，2005 ；Stoff-Khalili et al.，2008)。因此，可能需要其他控制方法获得使用自 杀基因表达治疗癌症所需的肿瘤选择性。因此，此方法可能被在某些条件下的显著脱靶表达所妨碍。例如，尽管细胞特异性 启动子介导的毒性基因表达可消除所述启动子在其中发挥功能的特定细胞类型衍生的肿 瘤细胞，然而这一方法也会因所述细胞启动子在健康细胞中诱导的表达而杀死健康细胞。已对组织特异性启动子和肿瘤选择性启动子就自杀基因表达进行了试验，以使对 非靶标正常细胞的杀死效应最小化。区分组织特异性启动子和肿瘤选择性启动子倚赖启动 子在正常和肿瘤组织中的相对活性，并且它们之间的分界线经常是模糊的(Harrington et al.，2000)。除上述缺点以外，体内最精密的器官一中枢神经系统(CNS)的独特特征使得成功的组织或细胞靶向的基因表达存在几个障碍。在CNS中发现的细胞类型极为不同，其中许 多对生理功能极为重要，并对基因表达的任何变化都高度敏感。使用选择性靶向方法来控 制治疗基因的表达，例如使用自杀基因表达的试验，通常涉及表达毒性自杀基因的载体的 直接肿瘤内注射，藉此将治疗基因表达局限于肿瘤组织。然而，由于大多数病毒载体的天然 感染谱并不局限于肿瘤组织，因此肿瘤内注射的载体可能泄露到正常组织中是一个问题， 并且可能造成健康细胞的附带破坏。尽管这种破坏在某些器官中是可忍受的，然而其在敏 感器官例如脑中可能引起严重的后果。这些具体挑战要求建立特异性方法以在CNS细胞中表达转基因，包括局限于具体 CNS细胞类型的基因表达，藉此确保在所需细胞中的治疗效果，并且限制由在非靶CNS细胞 中的基因表达造成的副作用。神经胶质瘤是原发性脑肿瘤的最常见类型之一。神经胶质瘤可以是高度浸润的， 极有侵袭性，并可能是最难治的人癌症形式之一(Ciafre et al. ,2005 ；Pulkkanen and Yla-Herttuala, 2005)。神经胶质瘤源于神经胶质细胞，主要是星形细胞，随着恶性水平增 加分级为I到IV。IV级神经胶质瘤，也称为多形性成胶质细胞瘤(GBM)，包括近半的神经胶 质瘤并且是成年人中最常见的原发性脑肿瘤。神经胶质瘤的常规治疗例如手术、Y照射和 化疗对神经胶质瘤无效，证据是神经胶质瘤患者的预后很差，这些患者在诊断后的平均存 活时间不到一年。正在研究的疗法例如靶向基因表达仍然是最有希望的治疗神经胶质瘤的方法之 一。这些方法需要建立一种可特异性杀死肿瘤细胞同时不影响CNS的非靶健康细胞的选择 性靶向方法。因此，使用治疗性自杀基因的肿瘤特异性表达来治疗神经胶质瘤的充分潜力将从 建立可更精确地控制神经胶质瘤细胞内自杀基因表达而不靶向CNS健康细胞的方法中获益。
技术实现思路
在一个方面中，本专利技术提供一种核酸分子，包含一个神经胶质特异性启动子；一 段转基因编码序列；和多个miRNA靶位点；其中每个miRNA靶位点均结合一个在神经胶质 瘤细胞中相比于在正常神经胶质细胞中下调的miRNA，并且其中所述神经胶质特异性启动 子和所述多个miRNA靶位点均可操作地连接于所述转基因编码序列。所述神经胶质特异性启动子可为星形细胞特异性启动子，包括胶质细胞原纤维酸 性蛋白启动子。所述多个miRNA靶位点可以包含至少一个has-miR-31、has-miR-127或 has-miR-143靶位点。在某些实施方案中，所述多个miRNA靶位点包含至少一个 has-miR-31靶位点、至少一个has-miR-127靶位点和至少一个has-miR-143位点；或者至 少两个has-miR-31靶位点、至少两个has-miR-127靶位点和至少两个has-miR-143位点。所述转基因可编码一种使神经胶质瘤细胞被直接杀死的基因产物、一种免疫调节 蛋白、一种细胞毒素、一种血管生成抑制蛋白、一种肿瘤抑制蛋白、一种自杀蛋白、一种凋亡 蛋白、一种抗血管生成蛋白或一种抗体。例如，所述转基因可编码HSV-tk或DT-A。在另一方面，本专利技术提供了一种包含如本文所述的本专利技术核酸分子的表达载体。所述表达载体可为杆状病毒载体。在又一方面，本专利技术提供了一种在神经胶质瘤细胞中表达转基因的方法，包括用 本专利技术的表达载体转染神经胶质瘤细胞。所述神经胶质瘤细胞可为体外(in vitro)细胞、从受试者体内移出到体外的离体 (ex vivo)细胞或者受试者的体内(in vivo)细胞。在本专利技术的另一方面，提供了一种包含本专利技术表达载体的转基因细胞。在本专利技术的又一方面，提供了 一种包含本专利技术表达载体的药物组合物。在本专利技术的再一方面，提供了一种包含本专利技术表达载体和用于在神经胶质细胞中 表达转基因的说明书的试剂盒。本领域技术人员在阅读以下本专利技术具体实施方式和附表和附图的描述后会明了 本专利技术的其他方面和特征。附图说明在仅以举例的方式说明本专利技术实施方案的表和图中表1 用于构建本专利技术表达载体的具体实施方案的引物的序列。图1 用于调节转基因表达的miRNA的选择。(a)在正常人星形细胞中具有高拷贝 数并且在成胶质细胞瘤细胞中显著下调的miRNA的鉴定。基于来自10个微阵列测定的10 个星形细胞样品的平均信号强度和使用实时PCR定量的miR-31的绝对拷贝数估计了正常 星形细胞中不同miRNA的拷贝数。图中包括231个在正常本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸分子，包含：一个神经胶质特异性启动子；一段转基因编码序列；和多个ｍｉＲＮＡ靶位点；其中每个ｍｉＲＮＡ靶位点均结合一个在神经胶质瘤细胞中相比于在正常神经胶质细胞中下调的ｍｉＲＮＡ，并且其中所述神经胶质特异性启动子和所述多个ｍｉＲＮＡ靶位点均可操作地连接于所述转基因编码序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2008.05.19 US 61/071,8141.一种核酸分子，包含 一个神经胶质特异性启动子； 一段转基因编码序列；和 多个miRNA靶位点；其中每个miRNA靶位点均结合一个在神经胶质瘤细胞中相比于在正常神经胶质细胞 中下调的miRNA，并且其中所述神经胶质特异性启动子和所述多个miRNA靶位点均可操作 地连接于所述转基因编码序列。2.权利要求1的核酸分子，其中所述神经胶质特异性启动子是星形细胞特异性启动子。3.权利要求2的核酸分子，其中所述神经胶质特异性启动子是胶质细胞原纤维酸性蛋 白启动子。4.权利要求1- 3任一项的核酸分子，其中所述多个m i RNA靶位点包含至少一个 has-miR-31、has-miR-127 或 has-miR-143 靶位点。5.权利要求4的核酸分子，其中所述多个miRNA靶位点包含至少一个has-miR-31靶位 点、至少一个has-miR-127靶位点和至少一个has-miR-143靶位点。6.权利要求5的核酸分子，其中所述多个miRNA靶位点包含至少两个has-miR-31靶位 点、至少两个has-miR-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·王，C·吴，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：SG