本发明专利技术公开了产脂肪酸工程菌及其制备方法和应用。本发明专利技术提供的制备产脂肪酸工程菌的方法，是灭活淡水丝状蓝细菌Anabaena?sp.PCC?7120中asr1131蛋白，得到产脂肪酸工程菌；所述asr1131蛋白的氨基酸序列如序列表的序列3所示。用所述方法制备得到的工程菌，细胞内的游离钙离子浓度升高，类囊体膜增多并充斥整个细胞，内膜组分多于野生菌，生长速度快于野生菌，总脂肪酸含量高于野生菌，很多重要脂肪酸含量也高于野生菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种产脂肪酸工程菌及其制备方法和应用。
技术介绍
脂肪酸是一种重要的基础化工原料，来源于石油，动物油或者植物油等。作为不可再生资源，石油在全球的储备量有限并且面临过渡开采的危险。为了保护环境、节约能源， 可再生资源逐渐得到重视和利用。从动植物油中提取的各种脂肪酸，已经广泛应用于食品， 医药，化工等多个领域。通过生物技术改造，许多的微生物菌株也应用于脂肪酸生产，包括细菌、酵母、霉菌和藻类等。细菌包括嗜酸乳杆菌、浑浊红球菌等。酵母中的研究主要集中在一些假丝酵母和红酵母中。霉菌中代表菌株多属于孢霉、毛霉或曲霉。藻类多见于微藻属及紫球藻属。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种产脂肪酸工程菌及其制备方法和应用。本专利技术提供了 DNA片段P，自上游至下游依次包括同源臂1\、DNA片段M和同源臂T2 ；所述同源臂T1和同源臂T2能与asrll31蛋白的编码基因发生同源重组，灭活所述 asrll31蛋白；所述DNA片段M为标记基因；所述asrll31蛋白的氨基酸序列如序列表的序列3所示。所述asrll31蛋白的编码基因的核苷酸序列可如序列表的序列4所示。所述标记基因片段可为抗生素抗性基因，如卡那霉素抗性基因。所述DNA片段P的核苷酸序列具体可如序列表的序列5所示。含有所述DNA片段P的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本专利技术的保护范围。所述重组载体具体可为将所述DNA片段P插入PRL277质粒的多克隆位点得到的重组质粒III。所述重组菌具体可为将所述重组质粒111、质粒？扎443和质粒？扎528导入大肠杆菌HBlOl得到的重组菌。本专利技术提供的制备产脂肪酸工程菌的方法，是灭活淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120中asrll31蛋白，得到产脂肪酸工程菌；所述asrll31蛋白的氨基酸序列如序列表的序列3所示。可将任一所述DNA片段P导入所述淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120，通过 DNA片段P和淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120的同源重组实现所述灭活。具体可将所述重组菌与淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120共培养实现所述灭活。以上任一所述方法制备得到的产脂肪酸工程菌也属于本专利技术的保护范围。淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120，是一种通常用来研究蓝细菌光和作用及固氮作用的模式菌株，这种蓝细菌是光合自养生长，细胞内具有按规律排布的细胞内膜(类囊体膜)，这些内膜系统富含膜脂及藻胆蛋白。本专利技术中将淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120中的一个钙结合蛋白灭活，得到了工程菌Δ 1131。工程菌Δ 1131细胞内的游离钙离子浓度升高，类囊体膜增多并充斥整个细胞，内膜组分多于野生菌，生长速度快于野生菌，总脂肪酸含量高于野生菌，很多重要脂肪酸含量也高于野生菌。工程菌Δ 1131的优点如下1、相比于目前通常应用的产脂肪酸菌株，培养条件简单。工程菌Δ 1131能够进行光合自养，只需要光照和无机盐培养基，不产毒及有害气体。培养细菌和酵母所用培养基多为有机培养基，部分霉菌会产生孢子有害人体健康，微藻的培养难度较高并易被污染。2、生长较为快速，代时约为20小时，相对于其它藻类(微藻代时44 91小时，紫球藻代时3 5天)有明显优势。目前研究较多的微藻在液体培养时达到较低浓度就会饱和停止增长，而工程菌Δ 1131则能一直维持生长并收获较多菌体。3、产生的脂肪酸占生物量的比例较高，高于22.5%。根据文献报道，在脂肪酸含量很高的2个微藻藻种中也是达到了 22. 3%,由于该菌株生长更加快速且培养方便，同样时间内能获得更多的总脂肪酸。4、棕榈酸、棕榈油酸、亚麻酸、亚麻油酸均有一定的含量，这是一些对人体有益的物质，肉豆寇酸也比较重要，但是含量较低。工程菌Δ 1131的肉豆寇酸含量是野生菌的两倍以上，亚麻油酸，棕榈油酸和油酸的含量也比野生菌高，而棕榈酸和亚麻酸的含量相当。 亚麻油酸是一种人体所需的重要物质，棕榈油酸和油酸是工业和食用原料，肉豆寇酸是香料，都具有比较广泛的应用前景。5、在能够生产大量脂肪酸的同时还能收获藻胆蛋白，由于类囊体膜的增加同时能使藻胆蛋白的含量增多，这类蛋白这也是食品与化妆品工业上的优质天然色素并能应用于合成新型荧光探针。提取藻胆蛋白的方法在细胞破碎后加入水溶液洗涤破碎产物， 10000rpm/min高速离心10分钟，此时将沉淀物应用于脂肪酸萃取，上清水溶液为带有蓝紫色荧光的藻胆蛋白水溶液，通过硫酸铵饱和沉淀方法得到粗提的藻胆蛋白沉淀，经过冷冻干燥即可获得粗提的藻但蛋白粉末。6、该突变体能长时间的维持表型。附图说明图1为工程菌Δ 1131-Α的southern鉴定图。图2为工程菌Δ 1131-Α和野生菌的生长曲线。图3为工程菌和野生菌的丝状体(普通显微镜；图中标尺10 μ m) ；A 野生菌；B 工程菌Δ 1131-Α。图4为现有菌株(紫球藻)的细胞图片。图5为工程菌Δ1131-Α和野生菌生长72小时的细胞(透射电镜；图中标尺 2μ ) ；A 野生菌；B 工程菌 Δ1131-Α。图6为长时间培养后(生长240小时)，工程菌Δ1131-Α的细胞图片(透射电镜； 图中标尺500nm)。图7为总脂肪酸甲酯化后的气相色谱图。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。质粒pRL277 北京大学；参考文献Conjugal transfer of DNA tocyanobacteria. Elhai J, Wolk CP. Methods Enzymol. 1988 ; 167 :747_540质粒pRL443 北京大学；参考文献Conjugal transfer of DNA tocyanobacteria. Elhai J, Wolk CP. Methods Enzymol. 1988 ; 167 :747_540质粒pRL528 北京大学；参考文献Conjugal transfer of DNA tocyanobacteria. Elhai J, Wolk CP. Methods Enzymol. 1988 ; 167 :747_540淡水丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120(野生菌，WT)购自美国ATCC (美国标准菌种收藏所；American Type Culture Collection)菌种库，编号 27893。pBS载体购自Stratagene公司，产品目录号ST212207。大肠杆菌HBlOl 购自takara公司，产品目录号D9051。微量元素溶液A5 2. 86g硼酸、1. 81g氯化锰·4Η20、0. 222g硫酸锌、0. 39g钼酸钠、 0. 079g硫酸铜· 5Η20、49· 4g硝酸钴· 6H20，加蒸馏水至1升。Bgll液体培养基1. 5g硝酸钠、0. 04g磷酸氢二钾、0. 075g硫酸镁· 7H20、0. 036g 氯化钙· 7H20、0. 0本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．ＤＮＡ片段Ｐ，自上游至下游依次包括同源臂Ｔ１、ＤＮＡ片段Ｍ和同源臂Ｔ２；所述同源臂Ｔ１和同源臂Ｔ２能与ａｓｒ１１３１蛋白的编码基因发生同源重组，灭活所述ａｓｒ１１３１蛋白；所述ＤＮＡ片段Ｍ为标记基因片段；所述ａｓｒ１１３１蛋白的氨基酸序列如序列表的序列３所示。
【技术特征摘要】
1.DNA片段P，自上游至下游依次包括同源臂I\、DNA片段M和同源臂T2 ；所述同源臂T1 和同源臂1~2能与asrll31蛋白的编码基因发生同源重组，灭活所述asrll31蛋白；所述DNA 片段M为标记基因片段；所述asrll31蛋白的氨基酸序列如序列表的序列3所示。2.如权利要求1所述的DNA片段P，其特征在于所述asrll31蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表的序列4所示；所述标记基因片段为抗生素抗性基因片段。3.如权利要求2所述的DNA片段P，其特征在于所述DNA片段P的核苷酸序列如序列表的序列5所示。4.含有权利要求1-3中任一所述DNA片段P的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为将所述DNA片段P插入pRL277质粒的多克隆位点得到的重组质粒III。6.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为将重组质粒III...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵进东，张蔚，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11
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