一种ｓｉＲＮＡ靶向分子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种ｓｉＲＮＡ靶向分子及其应用。该ｓｉＲＮＡ靶向分子正义链为ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：３，反义链为ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：４，其中，反义链可特异性地与ＨＢＶ聚合酶基因的ｍＲＮＡ结合，降解ｍＲＮＡ，从而干扰转录后翻译过程，达到抗乙型肝炎病毒的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种siRNA靶向分子及其应用。
技术介绍
肝炎，即肝脏炎症，有多种致病因素-如病毒、细菌、寄生虫、化学毒物、药物和毒 物、酒精等，侵害肝脏，使得肝脏的细胞受到破坏，肝脏的功能受到损害，它可以引起身体的 一系列不适症状，以及肝功能指标的异常。肝炎多数情况下指是由甲型、乙型、丙型、丁型、 戊型等肝炎病毒引起的病毒性肝炎。乙型肝炎病毒Ofepatitis B virus, HBV)感染导致的乙型肝炎，是一种严重威胁 全球人类健康的的传染性疾病，也是最严重类型的病毒性肝炎，它可造成慢性肝病，患者死 于肝硬化和肝癌的风险极高。HBV属嗜肝DNA病毒科Ofepadnaviridae)，全基因组长约3. 2kb，为部分双链环状 DNA。其基因组共有四个开放阅读框(Open Reading Frame，0RF)，编码蛋白包括表面抗原 (S基因)，核心抗原(C基因)，聚合酶蛋白(P基因)和X蛋白(C基因)。据世界卫生组织报道，全世界估计有20亿人感染HBV，其中有3. 5亿以上的人为慢 性乙肝感染者，估计每年有60万人死于急性或慢性乙型肝炎。HBV可造成急性病患，症状可 持续数周，包括皮肤和眼睛发黄(黄疸)，尿色深，极度疲劳，恶心，呕吐和腹痛。患者可能需 要数月乃至一年才能痊愈。乙型肝炎病毒也会造成慢性肝脏感染，以后可能发展成肝硬化 或肝癌。乙型肝炎病毒通过与受感染者的血液或其他体液(比如，精液和阴道分泌物)接 触而在人与人之间传播，传播途径与人类免疫缺陷病毒(艾滋病毒)相同。乙型肝炎病毒 的传染性比艾滋病毒强50-100倍，乙型肝炎病毒在体外可存活至少7天以上。在此期间， 如果病毒进入未感染者的身体，它依然可造成感染。病毒潜伏期平均达90天，但也可能为 大约30至180天不等。乙型肝炎病毒在感染后30至60天即可发现，持续时间差别很大。目前主要是通过婴儿接种乙型肝炎疫苗来预防乙型肝炎的发生，但尽管如此，人 群HBV流行率仍然很高。目前主要治疗慢性乙型肝炎的方法仅局限于抑制患者体内病毒基 因的表达和复制。如口服核苷类抗病毒药-拉米夫定，主要功能是抑制HBV的复制，但是停 药后复发率高，长期应用则可导致病毒变异，在用药6个月后发生由病毒聚合酶基因发生 变异引起的耐药性，使得临床抗病毒治疗面临极大的挑战。近几年来，随着RNA干扰(RNAi)技术的迅猛发展，为疾病尤其是癌症开辟了 全新的治疗途径，为科研工作者提供了一个全新的基因治疗方法。该技术通过用小 干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)干扰特定靶基因的表达，来达到治疗疾病 的目的，是基因治疗的重要组成部分。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是由双链 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)引发的转录后基因沉默机制。其作用机制是核糖核 酸酶III家族的Dicer酶，与dsRNA结合，将其剪切成21_23nt及3’端突出的siRNA，随后 siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合到靶信使RNA(mRNA)上并将其切 断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达。RNAi已作为一种简单有效的基因 敲除的技术，广泛地应用于功能基因组学研究以及抗病毒、抗肿瘤治疗的研究中。本专利技术提供了一种用RNAi技术来抗HBV的方法。应用RNA干扰技术，用靶向至 HBV基因的siRNA作为靶向药物，在基因的转录后进行干扰，从而有效抑制HBV的蛋白表达 和病毒复制，具有特异性强、高效、副作用小、可持续用药的优势，且能弥补目前治疗乙型肝 炎药物的不足，在不久的将来可能成为一种新的治疗乙型肝炎的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种通过siRNA全位点分子库技术筛选出的高效靶向HBV 基因的双链siRNA分子，其下述正义链和反义链组成正义链5，-GAACCUUUACCCC⑶UGCCCGGCNN-3，(SEQID NO 3)反义链5，-GCCGGGCAACGGGGUAAAG⑶UCNN-3，(SEQID NO 4)其中，N是A、T、C、G或U碱基的任何一种。换言之，该双链siRNA分子的主干序列为正义链5，-GAACCUUUACCCC⑶UGCCCGGC-3，(SEQID NO 5)反义链5，-GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC-3，(SEQID NO 6)在一个优选的实施方式中，上述序列中3，端的“NN”是两个脱氧胸腺嘧啶dTdT。本专利技术的另一目的在于提供上述siRNA分子在制备抗HBV药物中的应用。体外实验证明，本专利技术的siRNA分子的反义链可特异性地与HBV聚合酶基因的 mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，抑制HBV蛋白质翻译和病毒复制，达到抗 HBV的治疗目的。附图说明图1是抽提的HBV基因组琼脂糖凝胶电泳检测图。M为Ikb plus DNA Ladder (标 准参照)。图2A HBV聚合酶片段1琼脂糖凝胶电泳检测图，制备得到的DNA片段大小为 1625bp。图2B是HBV聚合酶片段2琼脂糖凝胶电泳检测图，制备得到的DNA片段大小为 874bp。M 为 Ikb plus DNA Ladder (标准参照)。图3是siRNA分子库构建流程示意图。图4是TO-siRNA转录模板-Hl表达框结构示意图。图5是PCR制备的TO-siRNA转录模板-Hl表达框纯化后琼脂糖凝胶电泳检测图。 图中，M 为 Ikb plus DNA Ladder (标准参照)；1 为 HBV-22 ；2 为 HBV-676 ；3 为 HBV-877 ；4 为 HBV-638 ；5 为 HBV-1003 ；6 为 HBV-748 ；7 为 HBV-182 ；8 为 HBV-261 ；9 为阴性对照。图6是表达框转染细胞后实时定量PCR检测HBV聚合酶基因mRNA表达量柱形图， 纵坐标表示HBV聚合酶基因mRNA表达水平；横坐标表示处理实验组，Negative Control” 为阴性对照组。具体实施例方式本专利技术中诸如“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”等术语可以互换，其表示的 意思和范围相同。其中，siRNA序列可以是单链结构，也可以是双链结构。本专利技术的siRNA分子来源于针对HBV聚合酶基因的功能保守区而制备的siRNA分 子库，本专利技术所用siRNA全位点分子库技术是百奥迈科生物技术有限公司的专利技术(中 国专利技术专利号为ZL 200710024217. 6，专利名称PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备 方法)，其优点在于所制备得到的siRNA随机分布于HBV聚合酶基因区段，长度可控性分布 于18-25bp，可以提高有效靶位点的命中率。siRNA的制备可采用多种方法，比如化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载 体表达siRNA、PCR合成siRNA表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间， 可以更好地获得基因沉默效率。本专利技术的siRNA分子可以作为抗HBV药物的有效成分。作为该siRNA分子的另一种表达形式，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ｓｉＲＮＡ靶向分子，其特征在于，具有如下序列结构：正义链：５’－ＧＡＡＣＣＵＵＵＡＣＣＣＣＧＵＵＧＣＣＣＧＧＣＮＮ－３’ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３，反义链：５’－ＧＣＣＧＧＧＣＡＡＣＧＧＧＧＵＡＡＡＧＧＵＵＣＮＮ－３’ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，其中，Ｎ是Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ或Ｕ碱基的任何一种。

【技术特征摘要】
一种siRNA靶向分子，其特征在于，具有如下序列结构正义链5’ GAACCUUUACCCCGUUGCCCGGCNN 3’SEQ ID NO3，反义链5’ GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUCNN 3’SEQ ID NO4，其中，N是...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆毅祥，李铁军，孙云成，唐小军，王晋康，朱远源，付博峻，M格拉汉姆，
申请(专利权)人：百奥迈科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：32[]