本发明专利技术提供一种检测活动性肺结核病的诊断试剂盒，由RNA提取缓冲液，活动性肺结核病特异的血清miRNA组合物、内参反转录引物、PCR引物以及荧光定量RT-PCR反应液构成，其中活动性肺结核病特异的血清miRNA组合物由4个差异表达的血清miRNAs组成：hsa-miR-29c、hsa-miR-22、hsa-miR-320b和hsa-miR-101。本发明专利技术采用活动性肺结核病的特异血清miRNAs组合，在血清miRNAs水平上对活动性肺结核病检测，灵敏度为90.2%、特异性为75.0%，对活动性肺结核病具有早期诊断价值，可实现对活动性肺结核病的早期预警和早期诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于血清生物学标志物研究，涉及检测活动性肺结核病特异的miRNA的试剂盒，通过一种能鉴定活动性肺结核病特异的miRNA去捕获血清生物学标志物，并用有定量控制的miRNA分析，在血清中检测活动性肺结核病。
技术介绍
肺结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性肺部感染性疾病，是严重威胁人类健康的疾病。中国流行形势十分严峻；现有活动性肺结核病患者约130万例，新发病例145万例/年，每年新发病例占全球人口总数的18%，死亡人数达13万例/年，超过了其他传染病死亡人数的总和。肺结核病的高发病和死亡率，以及通过空气传播,对病人、病人所接触的事物和社会都产生相当大的负担。因此，对肺结核病患者及时早期诊断是控制传染源，遏制肺结核病流行的最重要措施。目前，临床常规应用的诊断方法均有显著缺陷，如痰涂片检测一灵敏度低；结核分支杆菌培养一阳性率低(约30%)且耗时久(长达6-8周);胸部X线检查一无肺结核病特征性改变；PCR检测一假阳性和假阴性均高；结核菌素试验一不能区分结核自然感染和卡介苗接种；血清结核抗体检测一灵敏度和特异性均不理想。因此，迫切需要发现一种特异性强的新的生物学标志物，建立快速、敏感、高效的诊断技术，防止肺结核疾病蔓延。 近年来研究表明，血清中的miRNAs能作为诊断疾病的候选生物学标志物，研究涉及前列腺癌、肝癌、肺癌、大肠直肠癌、乳腺癌、白血病及卵巢癌等多种肿瘤，且血清是方便和容易得到的样品，从血清中寻找疾病生物标志物一直以来是人们研究的热点。由于miRNAs不易在血液中被各种酶降解，并且具有组织和细胞特异性，能够用于疾病分子诊断和疾病预后预测，适合作为疾病的候选生物学标志物。根据疾病生物标志物研究的要求，应用1-2个miRNAs作为疾病标志物，特异性低。同时由于不同患者的个体差异，使得仅用1-2个miRNAs判断疾病显得极不可靠。应该筛选出一组miRNAs,建立miRNAs的组合物可使结果更加可靠。所以，研究活动性肺结核病患者特异的血清miRNAs的组合物，作为生物标志物，对早期诊断肺结核病具有重要的意义。然而，目前尚无肺结核病特异血清miRNAs组合物的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测活动性肺结核病的诊断试剂盒，该试剂盒由RNA提取缓冲液，活动性肺结核病特异的血清miRNA组合物、内参反转录引物、PCR引物以及荧光定量RT-PCR反应液构成，其中活动性肺结核病特异的血清miRNA组合物由4个差异表达的血清 miRNAs 组成hsa_miR-29c、hsa-miR-22、hsa_miR-320b 和 hsa-miR-101。RNA提取缓冲液=QIAzof Lysis Reagent、氯仿、无水乙醇、RffT溶液、RPE溶液和RNAase-free 水。荧光定量RT-PCR反应液包括反转录和荧光定量PCR反应液；反转录反应液总RNA、反转录引物(2 μΜ)、5Χ反应缓冲液、dNTP (10 mM)、RNase抑制剂、反转录酶；荧光定量 PCR 反应液SYBR>re iz 位 Taq (Tli RnaseH Plus) (2X )、PCR 上游引物(10 μ Μ)、PCR 下游引物(10 μ Μ)、ROX Reference Dye (50X )、模板 cDNA 和 ddH20。逆转录引物序列为hsa-miR-29c :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG-3’ ；hsa-miR-22 :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGTT-3’ ；hsa-miR-320b :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCGTT-3’ ；hsa-miR-101 :5，-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAGT-3，；内参hsa-miR-16 :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’。PCR上游引物序列hsa-miR-29c :5’ -GGCGGTAGCACCATTTGAA-3’ ；hsa-miR-22 :5’ -CGGAAGCTGCCAGTTGAAGA-3’ ；hsa-miR-320b :5’ -AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCA-3’ ；hsa-miR-101 :5’ -GGGTACTGTGATAACTGAAGG-3’ ；内参 hsa-miR-16 :5，-CGCGCTAGCAGCACGTAAAT—3，。 PCR 通用的下游引物是5’ -AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。试剂盒的使用方法提取活动性肺结核病患者与健康对照者、肺炎、肺癌和慢性阻塞性肺病患者血清中的总RNA ;应用血清miRNA组合物hsa_miR-29c、hsa-miR-22、hsa-miR-320b和hsa-miR-101的特异反转录引物对样本的总RNA进行反转录得到cDNA ；应用PCR特异引物进行SYBR Green染料荧光定量PCR检测样本中血清miRNA的表达水平；应用MedCalc软件和Logistic逐步回归模型，分析血清组合物hsa-miR-29c、hsa_miR-22、hsa-miR-320b 和 hsa-miR-101 的 ROC 曲线，曲线下面积(AUC)是 O. 911 (P < O. 0001,95%Cl = O. 847-0. 954)，灵敏度为90. 2%、特异性为75. 0%，表明该特异血清miRNAs组合物诊断活动性肺结核病具有较高的准确性。本专利技术的另一个目的是提供所述的试剂盒在活动性肺结核病血清检测中的应用。本专利技术试剂盒具有以下优点(I)本专利技术采用活动性肺结核病的特异血清miRNAs组合，可应用于活动性肺结核病血清的早期检测，为活动性肺结核病的早期诊断提供了新的方法。并为开发miRNAs诊断试剂盒奠定了基础；(2)与以往传统的结核杆菌检测等方法相比，本专利技术是一种在血清miRNAs水平上的检测，对活动性肺结核病具有早期诊断价值；(3)本专利技术对活动性肺结核病检测的灵敏度为90. 2%、特异性为75. 0%，具有较高的准确性。因此本专利技术可实现对活动性肺结核病的早期预警和早期诊断；(4)本专利技术血清miRNA的检测技术先进、高通量，组合物的构建方法设计精确、合理可行，为提高活动性肺结核病的早期诊断提供了一种新的评估方法。附图说明图1是活动性肺结核病患者、健康对照者血清中hsa-miR-29c的表达水平。图2是活动性肺结核病患者、肺癌患者、肺炎患者及慢性阻塞性肺病患者血清中hsa-miR-29c的表达水平。图3是活动性肺结核病患者、健康对照者血清中hsa-miR-22的表达水平。图4是活动性肺结核病患者、肺癌患者、肺炎患者及慢性阻塞性肺病患者血清中hsa-miR-22的表达水平。图5是活动性肺结核病患者、健康对照者血清中hsa-miR-320b的表达水平。图6是活动性肺结核病患者、肺癌患者、肺炎患者及慢性阻塞性肺病患者血清中hsa-miR本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测活动性肺结核病的诊断试剂盒，由RNA提取缓冲液，活动性肺结核病特异的血清miRNA组合物、内参反转录引物和PCR引物以及荧光定量RT?PCR反应液构成，其中活动性肺结核病特异的血清miRNA组合物由4个差异表达的血清miRNAs组成：hsa?miR?29c、hsa?miR?22、hsa?miR?320b和hsa?miR?101；所述的RNA提取缓冲液有：QIAzol??Lysis?Reagent、氯仿、无水乙醇、RWT溶液、RPE溶液和RNAase?free水；所述的荧光定量RT?PCR反应液，包括反转录和荧光定量PCR反应液；其中反转录反应液有：总RNA、2?μM反转录引物、5×反应缓冲液、10?mM?dNTP、RNase抑制剂、反转录酶；荧光定量PCR反应液有：SYBR?Premix?Ex?Taq?，Tli?RnaseH?Plus、PCR上游引物、PCR下游引物、ROX?Reference?Dye、模板cDNA和ddH2O；逆转录引物序列为：hsa?miR?29c：5’?GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG?3’，hsa?miR?22：5’?GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGTT?3’，hsa?miR?320b：5’?GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCGTT?3’，hsa?miR?101：5’?GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAGT?3’，内参hsa?miR?16：5’?GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA?3’，PCR上游引物序列为：hsa?miR?29c：5’?GGCGGTAGCACCATTTGAA?3’，hsa?miR?22：5’?CGGAAGCTGCCAGTTGAAGA?3’，hsa?miR?320b：5’?AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCA?3’，hsa?miR?101：5’??GGGTACTGTGATAACTGAAGG?3’，内参hsa?miR?16：5’?CGCGCTAGCAGCACGTAAAT?3’；PCR通用的下游引物序列是：5’?AGTGCAGGGTCCGAGGTATT?3’。...
【技术特征摘要】
1.一种检测活动性肺结核病的诊断试剂盒，由RNA提取缓冲液，活动性肺结核病特异的血清miRNA组合物、内参反转录引物和PCR引物以及荧光定量RT-PCR反应液构成，其中活动性肺结核病特异的血清miRNA组合物由4个差异表达的血清miRNAs组成hsa-miR-29c、hsa-miR-22、hsa_miR-320b 和 hsa-miR-101 ;所述的 RNA 提取缓冲液有QIAzol Lysis Reagent、氯仿、无水乙醇、RffT溶液、RPE溶液和RNAase-free水；所述的突光定量RT-PCR反应液，包括反转录和荧光定量PCR反应液；其中反转录反应液有总RNA、2剛反转录引物、5X反应缓冲液、10 mM dNTP、RNase抑制剂、反转录酶；荧光定量PCR反应液有SYBR7￥e iz 位 Taq , Tli RnaseH Plus、PCR 上游引物、PCR 下游引物、ROX ReferenceDye、模板 cDNA 和 ddH20 ； 逆转录引物序列为hsa-miR-29c :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG-3’，hsa-miR-22 :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGG...
【专利技术属性】
技术研发人员：李继承，张星，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。