禽肺炎病毒的LAMP检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种禽肺炎病毒的LAMP检测试剂盒。该试剂盒中含有针对禽肺炎病毒F基因保守区域的8个区域设计的6条引物组成的引物组，其核苷酸序列如序列表序列1至序列6所示。本发明专利技术所提供的试剂盒可特异检出禽肺炎病毒，最低检出限为100fg/μL，其敏感性为常规RT-PCR的100倍。本发明专利技术具有检测快速且成本低，不需要昂贵的仪器并且操作方法更简单，适于临床快速检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种禽肺炎病毒的LAMP检测试剂盒。
技术介绍
禽肺炎病毒(Avian pneumo virus, APV)是禽偏肺炎病毒属的成员，属于禽副黏病毒科。该病毒主要危害火鸡和不同品种的鸡，包括种鸡、商品肉鸡和鸡蛋，发病日龄一般在4一7周龄，5— 6周龄为发病高峰，主要引起上呼吸道的症状，以喷嚏，眼结膜潮红，泪腺肿，头部出现皮下水肿，俗称肿头；产蛋鸡感染主要引起产蛋下降2% — 40%，孵化率降低；随着病情的发展，还表现出神经症状；该病引起的发病率在1% — 90%之间，引起鸡死亡率在1%—20%，在发病期间继发其它疾病的感染，会引起更大的死亡，造成对养禽业尤其是种禽的极大危害。目前，检测禽肺炎病毒的方法有病毒鸡胚分离、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光技术(IFA)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)、基因芯片(Gene chips)。传统的病毒鸡胚分离方法准确、简便，但耗时太长，通常需要两天到一周的时间；IFA、ELISA快速但需要特殊试剂；RT-PCR、RRT-PCR、Gene chips检测技术快速、灵敏，但都需要特殊仪器和技术人员，且成本较高，不适合在基层推广使用。环介导等温基因扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的链置换DNA聚合酶(即Bst DNA聚合酶)，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应，整个反应不需要特殊的仪器设备，仅在水浴锅中就可完成。LAMP技术在目的基因保守区设计针对6个特异区域的4条引物(内引物两条分别为FIP和BIP、外引物两条分别为F3和B3)，为了进一步提高反应的特异性，还可设计两条环引物；LAMP反应结果的观察方法非常简便，反应结束后可通过肉眼在可见光或紫外线下直接观察反应液的颜色变化来判定结果。LAMP具有简便、快速、灵敏、特异的优势，尤其适合在基层检测应用。在LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测禽肺炎病毒的环介导等温基因扩增引物组。本专利技术所提供的弓丨物组包括弓丨物I、引物2、引物3和引物4 ;所述引物I的核苷酸序列如序列表序列I所示所述引物2的核苷酸序列如序列表序列2所示所述引物3的核苷酸序列如序列表序列3所示所述引物4的核苷酸序列如序列表序列4所示。在上述引物组中，还包括引物5和引物6 ;所述引物5的核苷酸序列如序列表序列5所示；所述引物6的核苷酸序列如序列表序列6所示；在上述引物组中，所述引物组具体由所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6组成。在上述引物组中，所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物 6 的摩尔比为(15-17) : (15-17) : (7.5-8.5): (7.5-8.5): (7.5-8.5):(7. 5-8. 5);具体可为 16:16:8:8:8:8。本专利技术的另一个目的是提供一种检测禽肺炎病毒的环介导等温基因扩增试剂。本专利技术所提供的环介导等温基因扩增试剂由上述任一所述的引物组、环介导等温基因扩增缓冲液、链置换DNA聚合酶(即Bst DNA聚合酶)、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱、钙黄绿素、氯化锰和水组成。在上述试剂中，所述引物组中的所述引物I在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为 15 μ mol/ μ L一17 μ mol/ μ L ;具体可为 16 μ mol/ μ L ；所述引物组中的所述引物2在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为15 μ mol/ μ L—17 μ mol/ μ L ;具体可为 16 μ mol/ μ L ；所述引物组中的所述引物3在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为7. 5 μ mol/ μ L—8. 5 μ mol/ μ L;具体可为 8 μ mol/ μ L ；所述引物组中的所述引物4在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为7. 5 μ mol/ μ L—8. 5 μ mol/ μ L ;具体可为 8 μ mol/ μ L ；所述引物组中的所述引物5在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为7.5 μ mol/ μ L—8. 5 μ mol/ μ L ;具体可为 8 μ mol/ μ L ；所述引物组中的所述引物6在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为7.5 μ mol/ μ L—8. 5 μ mol/ μ L ;具体可为 8 μ mol/ μ L。在上述试剂中，所述链置换DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱、钙黄绿素、氯化锰的终浓度分别为 0. 32U/ μ L、I. 4mmol/L、2mmol/L、lmol/L、25 μ mol/L、0. 5mmol/L。本专利技术的还提供一种检测禽肺炎病毒的环介导等温基因扩增试剂盒。本专利技术所提供的试剂盒包括上述任一所述引物组或所述环介导等温基因扩增试剂。本专利技术保护上述任一所述的引物组或所述环介导等温基因扩增试剂或所述环介导等温基因扩增试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有禽肺炎病毒产品中的应用。在上述应用中，所述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有禽肺炎病毒包括用上述任一所述引物组或所述环介导等温基因扩增试剂或所述环介导等温基因扩增试剂盒对所述待测样品进行环介导等温基因扩增反应的步骤。本专利技术针对禽肺炎病毒F基因保守序列设计了六条特异的LAMP引物组，利用该引物组进行LAMP检测可特异检出禽肺炎病毒，最低检出限为IOOfg/μ L，其敏感性为常规RT-PCR的100倍。本专利技术具有检测快速且成本低，不需要昂贵的仪器并且操作方法更简单，适于临床快速检测。附图说明图I为本专利技术禽肺炎病毒LAMP检测试剂盒的特异性检测结果。图2为本专利技术禽肺炎病毒LAMP检测试剂盒的敏感性检测结果。图3为RT-PCR检测禽肺炎病毒的敏感性结果。图4为本专利技术禽肺炎病毒LAMP检测试剂盒对临床样品的检测结果。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的毒株或菌株的信息如下禽肺炎病毒毒株MN2a :文献Bruce S. Seal, Holly S. Sellers, RichardJ. Meinersmann. Fusion protein predicted amino acid sequence of the first USavian pneumovirus isolate and lack of heterogeneity among other US isolates.Virus Research. 66(2000) 139 - 147.公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。鸡新城疫病毒毒株Lasota、禽脑脊髓炎病毒毒株Van Roekel ;鸡毒霉形体毒株S6、鸡传染性支气管炎病毒毒株Mass41、鸡传染性喉气管炎病毒毒株北京株、禽呼肠孤病毒毒株S1133和禽巴氏杆菌菌株C48-1 :文献Zhiqin Xie (谢志勤)等，Reverset本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测禽肺炎病毒的环介导等温基因扩增引物组，其特征在于：所述引物组中包括引物1、引物2、引物3和引物4；所述引物1的核苷酸序列如序列表序列1所示；所述引物2的核苷酸序列如序列表序列2所示；所述引物3的核苷酸序列如序列表序列3所示；所述引物4的核苷酸序列如序列表序列4所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，谢志勤，刘加波，庞耀珊，邓显文，谢丽基，范晴，罗思思，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：