【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及嗜水气单胞菌hcp蛋白多克隆抗体的制备方法。
技术介绍
1、嗜水气单胞菌(aeromonas hydrophila，ah)是革兰氏阴性菌属于弧菌科气单胞菌属，是一种普遍存在于各种水体、土壤和环境中的条件性病原菌，是构成养殖水环境中正常菌群种类之一，能够引起鱼类、动物和人的多种疾病，如可诱发鱼类感染败血症。为国内外的水产养殖业带来巨大的经济损失。目前在水产养殖业中主要依靠抗生素抑制ah感染，抗生素的滥用不仅会导致ah产生耐药性，而且对生态环境与食品安全质量产生影响，引起食品质量安全问题和生态安全问题。水产养殖中水生生物容易受到ah的侵袭而产生疾病。虾的个体较小，逐一进行治疗不现实，而虾群在水体中也难以治疗。因此，控制该细菌在人群和水产养殖中的不断爆发具有重要意义。
2、ah的致病机制十分复杂，使宿主的疾病发生通常依靠分泌系统与毒力因子之间的相互作用。iv型分泌系统(type vi secretion system，t6ss)是ah的分泌系统之一，由13个蛋白组成，负责将部分效应蛋白运传递到细胞外。溶血素共调节蛋白(hemolysin co-regulated protein，hcp)是t6ss的蛋白质成分之一，hcp蛋白可以形成一个类似管状的六聚体，协助t6ss分泌毒力相关蛋白。hcp蛋白在t6ss系统中起着重要作用，既是其结构蛋白帮助形成注射装置分泌蛋白，又是其效应蛋白可以分泌到胞外增强毒力。现有的溶血素共调节蛋白获取比较困难，因此，需要设计嗜水气单胞菌hcp蛋白多克隆抗体的制备方法。p>
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供嗜水气单胞菌hcp蛋白多克隆抗体的制备方法，解决现有单胞菌hcp蛋白获取困难的技术问题。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
3、嗜水气单胞菌hcp蛋白多克隆抗体的制备方法，所述方法包括如下步骤：
4、步骤1：进行引物的设计与合成；
5、步骤2：进行hcp基因的扩增；
6、步骤3：原核表达质粒pet-32a-hcp的构建；
7、步骤4：进行重组hcp蛋白的诱导表达及优化表达条件；
8、步骤5：重组hcp蛋白表达形式的鉴定及纯化；
9、步骤6：进行重组hcp蛋白多克隆抗体的制备；
10、步骤7：兔抗hcp蛋白多克隆抗体效价的测定；
11、步骤8：兔抗hcp蛋白多克隆抗体反应性的测定；
12、步骤9：hcp蛋白的生物信息学分析。
13、进一步地，步骤1的具体过程为：
14、根据hcp基因序列设计hcp基因特异性引物，限制性酶切位点分别为ecor i和xhoi；
15、hcp-f：5'--3'：ccggaattcatgccaactccatgttatat；
16、hcp-r：5'--3'：cggctcgagttacgcctcgatcggagcac。
17、进一步地，步骤2的具体过程为：
18、以ah-sc-3的dna为模板，hcp-f/r为引物对进行pcr扩增，按照胶回收试剂盒操作说明对pcr产物进行胶回收。
19、进一步地，步骤3的具体过程为：
20、对目的基因hcp的胶回收产物和pet-32a(+)载体进行双酶切后再次进行胶回收，按照t4连接酶说明书对两个片段进行连接，将连接产物按照dh5α感受态细胞使用说明转化至dh5α感受态细胞，次日将单菌落扩繁后按照质粒抽提试剂盒操作说明提取质粒，对获得的质粒进行酶切鉴定并测序，命名为pet-32a-hcp。
21、进一步地，步骤4的具体过程为：
22、按照说明书将pet-32a-hcp转化至bl21感受态细胞涂布于含氨苄抗性的la平板，37℃恒温培养箱培养12h，挑取单菌落培养37℃150rpm培养6h，取部分菌液进行pcr鉴定，对鉴定正确的阳性克隆进行增菌培养，达到对数生长期后通过加入不同剂量的iptg和改变诱导时间来确定最佳诱导条件，收集菌液8 000rpm 3min弃上清，加入40μl pbs重悬沉淀并与10μl5×loading buffer混合，沸水浴10min后进行sds-page电泳。
23、进一步地，步骤5的具体过程为：
24、将表达的菌液进行超声裂解，裂解产物4 000rpm 10min分离上清和沉淀，将沉淀溶解于inclusion body elutio buffer，将40μl的上清与沉淀溶解液与10μl 5×loadingbuffer混合，沸水浴10min后进行sds-page电泳，确定表达形式后进行诱导，根据纯化试剂盒中的方法纯化蛋白。
25、进一步地，步骤6的具体过程为：
26、对家兔皮下多点注射。免疫结束后第7d进行心脏采血，收集血清，免疫前从兔耳缘静脉采血，分离血清作为阴性对照，免疫程序为：免疫次数：首免，蛋白质量：1mg，佐剂类型：弗氏完全佐剂；免疫次数：二免，蛋白质量：0.5mg，佐剂类型：弗氏不完全佐剂，间隔时间：14d；免疫次数：三免，蛋白质量：0.5mg，佐剂类型：弗氏不完全佐剂，间隔时间：14d；免疫次数：四免，蛋白质量：0.5mg，佐剂类型：弗氏不完全佐剂。
27、进一步地，步骤8的具体过程为：
28、收集27℃、150rpm过夜培养的嗜水气单胞培养物，分别以培养物上清与沉淀作为抗原，以1：4 000稀释的兔阳性血清和阴性血清为一抗，以1：10 000稀释的hrp山羊抗兔igg(h+l)为二抗进行western blotting以判断该抗体的反应性。
29、进一步地，步骤9的具体过程为：
30、使用在线生物信息学网站对hcp蛋白的理化性质、结构等预测，具体为使用expasy数据库的protparam和protscale工具分析基本理化性质和亲疏水性，使用signalp5.0、tmhmim2.0分别对蛋白质进行信号肽分析、跨膜结构域分析，使用netphos3.1和ncbi数据库的cd-search工具寻找蛋白质磷酸化位点和保守结构域，使用spoma和swiss-model分别预测蛋白质的二级结构和三级结构。
31、本专利技术由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：
32、本专利技术hcp蛋白属于亲水性蛋白，第117号氨基酸的疏水性最强，值为1.433，第55号氨基酸的亲水性最强，值为-1.911。蛋白质脂肪系数为73.66，不稳定系数为32.03，为稳定蛋白。使用protscale分析hcp蛋白的亲疏水性，氨基酸分值小于0表明具有亲水性，分值大于0表明具有疏水性。分析显示，hcp蛋白的大部分氨基酸位于亲水性区域，是亲水性蛋白，与蛋白质理化分析结果一致，蛋白的构成主要是无规则卷曲、延伸链、α-螺旋、β-转角。hcp作为效应蛋白的输出载体和伴侣，可以通过这些成分的共价延伸或通过非共价相互作用附着，因此hc本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.嗜水气单胞菌Hcp蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌Hcp蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤1的具体过程为：
3.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌Hcp蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤2的具体过程为：
4.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌Hcp蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤3的具体过程为：
5.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌Hcp蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤4的具体过程为：
6.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌Hcp蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤5的具体过程为：
7.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌Hcp蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤6的具体过程为：
8.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌Hcp蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤8的具体过程为：
9.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌Hcp蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤9的具体过程为：
...【技术特征摘要】
1.嗜水气单胞菌hcp蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌hcp蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤1的具体过程为：
3.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌hcp蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤2的具体过程为：
4.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌hcp蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤3的具体过程为：
5.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌hcp蛋白多克隆抗体的制...
【专利技术属性】
技术研发人员：何颖，陈忠伟，卢冰霞，许艺兰，陈婷婷，林森，黄广杰，梁家幸，周英宁，曾家家，何肇强，许佳乐，许心婷，赵硕，秦毅斌，段群棚，赵武，全琛宇，李斌，杨讯业，苏惠梅，黄运福，卢敬专，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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