本发明专利技术提供了一种禽白血病J亚群病毒PCR检测用引物及检测试剂盒。本发明专利技术通过分析禽白血病J亚群病毒env基因，设计了PCR检测用引物，所述引物核苷酸序列见序列表SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2。本发明专利技术引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为禽白血病J亚群病毒的鉴定提供了优良的检测方法。本发明专利技术还提供了禽白血病病毒检测试剂盒，其含有核苷酸序列如序列表SEQ?ID?No.1~2所示的引物对。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测禽白血病J亚群病毒的PCR检测用引物及检测试剂盒。
技术介绍
随着养禽业规模化养殖的不断深入，禽病的威胁也日益凸显。禽白血病(AvianLeukosis, AL)因其具有高感染率，在水平方向(鸡群之间交互感染)和垂直方向(该病能遗传给下一代)均能传播的特性，该病能感染所有鸡种，感染鸡群呈渐进性发病，持续的低死亡率，是危害养鸡业的主要疾病之一，全球每年因为禽类疾病而造成的经济损失高达数百亿元。但至今人类对禽白血病的防治几乎还无计可施，既没有疫苗可以利用，也没有有 效的药物可以治疗，控制禽白血病的主要方法是通过病原检测，淘汰阳性鸡，净化种群。目前，国际上检测禽白血病病毒抗原最为理想的检测方法是ELISA法，它具有敏感性高、简便快捷、适用于大规模检测的特点。1979年以来，禽白血病的ELISA诊断试剂盒在国外已实现商品化，尤其近年来，我国陆续培养建立了数家SPF鸡场，今后还会不断增加，对SPF鸡群AL / SV-gs抗原检查目前主要依靠进口试剂盒，不仅价格昂贵而且不方便。因此，研制较先进的国产试剂盒是我们当前急需要解决的问题。禽白血病是由禽白血病肉瘤病毒群中的病毒引起的鸡多种肿瘤性疾病的统称。以在成年鸡中产生淋巴样肿瘤和产蛋量下降为特征。禽白血病病毒的多数毒株能在11 12日龄鸡胚中良好生长，腹腔或其他途径接种I 14日龄易感雏鸡，可引起鸡发病。临诊上有多种表现形式，主要是淋巴白血病。禽白血病病毒目前来讲可分为A、B、C、D、E和J六个亚群。其中J亚群是90年代后在肉鸡中新发现的，是目前常见的具有致病性的病毒亚群。禽白血病病毒感染鸡只后，会降低鸡的生长和生产性能，或引起鸡出现严重的病理反应，甚至死亡，该病毒除了能通过髓细胞瘤在肉鸡引起较高死亡率外，还可引起鸡体重质量严重下降，严重情况下会引起鸡群爆发其他并发症，从而引起鸡群的大面积死亡。另外的五种亚群(A、B、C、D、E)能检测到病毒但是通常鸡只不发病。J亚群禽白血病是由反转录病毒科J亚群禽白血病病毒引起的一种传染性致骨髓细胞瘤疾病或成髓性白血病。该病自发现以来，以垂直和水平传播两种形式在世界各国肉种鸡、商品肉用型鸡及蛋种鸡中广泛流行，引起肉种鸡死亡和消瘦，严重生长发育不良，蛋鸡发生机体免疫抑制，繁殖性能持续降低，给世界各国养鸡业带来了极大的危害，因此对集约化养殖的鸡群进行J亚群病毒感染的检测，对养鸡业的发展具有重要意义。高感染率的禽白血病严重制约着养禽业的发展，并威胁着大规模养殖化的推广。因此，一种能快速、低成本、准确的检测大规模鸡是否感染禽白血病病毒的方法，对养殖业的发展具有重要意义。目前对于禽白血病的检测常采用ELISA试剂盒进行检测，其准确性较高，但有两大缺点1)价格非常昂贵，不适用于养殖场全群检测；2)ELISA试剂只能检测出外源性的禽白血病病毒，并且不能区别病毒各亚群。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种禽白血病的PCR检测用引物。本专利技术的另一目的在于提供检测禽白血病的试剂盒。本专利技术提供了一种禽白血病病毒PCR检测用引物，其能对禽白血病病毒的env基因进行扩增，生成禽白血病病毒特异性扩增片段。优选地，所述引物核苷酸序列如SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示。本专利技术提供了含有上述引物的诊断试剂。 本专利技术提供了含有上述引物的检测试剂盒。本专利技术提供了上述引物在制备禽白血病J亚群病毒诊断试剂盒检测试剂盒中的应用。本专利技术提供的检测禽白血病J亚群病毒的试剂盒，其检测步骤为检测步骤为I)分别抽取10 50只禽血液，个体DNA抽提后混合得到混合DNA ；2)将步骤I)的混合DNA应用引物进行PCR扩增，根据扩增目的条带判断；若样品扩增条带出现525bp的片段，则样品为禽白血病J亚群病毒感染阳性样品；若扩增条带没有525bp片段，则为阴性；所述引物序列如SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示。本专利技术提供的检测禽白血病J亚群病毒的PCR引物能够快速、准确地检测禽是否患有白血病J亚群病毒,含有该引物的检测试剂盒成本低,使用方便,能够解决目前鸡白血病高检测成本的问题。本专利技术是一种基于分子水平检测鸡白血病的技术；应用本专利技术引物构建的检测试剂盒操作简便快速，灵敏度高，特异性强，重复性好，大大降低了全群检测鸡白血病的时间及成本，可使全群快速检测鸡白血病得以实现，甚至普及。例如，ELISA方法检测10万只鸡群，平均每只鸡的检测成本在30元左右，而本专利技术试剂盒的成本不到I元。另外，工作时间上，ELISA法，平均每人每天一台仪器可检测400只左右，而本试剂盒则可以检测近千只。因此，采用本专利技术试剂盒可以在时间上缩短一半，成本上节约29倍。附图说明图I为检测体系？0 产物电泳图，其中，]\&^1 51'是01^2000，1、2、3、4、5、6、7号泳道分别是感染禽白血病J亚群病毒的鸡个体对应的PCR结果。图2为本专利技术PCR方法最低检测浓度的电泳图，使用8个梯度的DNA模板进行PCR 检测，其中 I 20μ g/ml ；2 10μ g/ml ；3 5μ g/ml ；4 2. 5μ g/ml ；5 :1. 25 μ g/ml ；6 0.625 μ g/ml ；7 :0. 313 μ g/ml ；8 :0. 157 μ g/ml，最右泳道为 Marker DL2000。。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例I PCR引物的设计禽白血病病毒RNA基因组的两端为非编码区，中间部分为编码区，编码区有4个结构基因，从5’到3’依次为gag / pro一pol一env。本专利技术针对J亚群禽白血病病毒特殊的erw基因序列，设计引物。经过多轮筛选，发现以下引物能够快速、准确地对J亚群禽白血病病毒进行定性检测。通过PCR扩增，能获得该env基因序列片度的个体即代表此个体含有J亚群禽白血病病毒。 本专利技术提供的检测J亚群禽白血病病毒的引物的核苷酸序列上游引物5’TTAAACCGGACATCACCCAAAAGGA 3’ (SEQID No. I)下游引物5’AGCACACCGAACCAAAGGTAACACA3’ (SEQID No. 2)0实施例2总DNA的提取(I)鸡血DNA的提取。取柠檬酸抗凝的血液样本10 μ L于I. 5mLEppendorf管中，力口入400 μ L缓冲液轻轻地摇匀；然后加入47. 7658/1001^的盐酸胍液10(^1^和2(^1蛋白酶K，漩涡振荡混匀后置于56°C金属浴消化5小时；加600 μ L氯仿，振荡离心4°C，12000rpm离心15min，取上清液转置另一 Eppendorf管中；取上清液，加等体积异丙醇，放在冰盒中沉淀2小时后离心4°C, 15min, 12000rpm,倾倒上清;加无水乙醇777 μ L,离心4°C，12000rpm,15min,弃上清液；加48 μ L (适量)超纯水溶解沉淀(及得到DNA溶液);用O. 8%的琼脂本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种禽白血病J亚群病毒PCR检测用引物，其特征在于，能对禽白血病J亚群病毒的env基因进行扩增，生成禽白血病病毒特异性扩增片段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱庆，兰茜，胡耀东，尹华东，刘益平，王彦，李天杰，尹月，吴杰，兰丹，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。