水中诺如病毒的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种水中诺如病毒的检测方法，它对样品经混合纤维素酯膜过滤浓缩、将滤过后的硝酸纤维素膜剪碎并随后放入10ml牛肉膏浸出液，超声振荡洗脱后离心，取上清液，将所述上清液分批加入离心超滤管进行高速离心超滤；然后再进行诺如病毒的检测。本发明专利技术具有极高检测灵敏性和准确度，极大减少取样量，方便检测工作，降低检测成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及水体中诺如病毒的检测方法。
技术介绍
诺如病毒为目前国际上报道最重要的非细菌性腹泻病原体，在我国诺如病毒的爆 发也时有报道。但目前国内外对诺如病毒的研究均W人群的粪便和海鲜品标本为主，针对 湖、河等水体中诺如病毒的检测报道较少。诺如病毒在水中虽然比较稳定但无法增值，导 致难W检测。 浙江省杭州地区最近几年发生多起诺如病毒爆发疫情，有几起疫情流行病学资料 都把传染源指向水源，但缺乏有效的水源中诺如病毒检测方式使疫情的传染源一直得不到 确认。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种，具有极高检测 灵敏性和准确度，极大减少取样量，方便检测工作，降低检测成本。 阳〇化]，其特征在于所述检测方法包括W下步骤： (一）第一步浓缩(1)、取水样SOOna-1000 ml,使用滤纸进行初过滤，去除水样的杂质； (2)、过滤后的水样中加入Mg2+,用盐酸调节水样使抑= 3-4;然后采用过滤装置使 水样通过孔径为0. 45ym混合纤维素醋膜；(3)、将滤过后的混合纤维素醋膜剪碎并随后放入IOml牛肉膏浸出液，超声振荡 洗脱后离屯、，取上清液； (二）第二步浓缩 将所述上清液分批加入离屯、超滤管进行高速离屯、超滤； 阳012] (S)对经第二步浓缩后的样品进行诺如病毒的检测。 本专利技术提供了一种适合基层使用的简单易行的诺如病毒检测方法。本方法简单高 效，试剂成本比较低，样品量达到数百毫升就可W进行检测，不受水质水量影响，避免了巨 量体积采样而导致的检测实际不可执行的问题，有很高的应用价值，适合基层疾控进行应 用和推广。 本专利技术对诺如病毒的灵敏度为3copy/y1，具有极高的灵敏度，能够完全满足实际 要求。 本专利技术对诺如病毒具有极强的特异性，不浓集病毒W外的物质。【附图说明】 图1为实施例4中的地表水检测巧光PCR检测图谱 图2为实施例4中的JV12/JV13PCR扩增电泳图【具体实施方式】 阳01引实施例1，对水体中诺如病毒的检测 (一）第一步浓缩（微孔滤膜吸附法） 1、对待测水体中取样500ml水样，使用滤纸进行初过滤，本步骤主要去除水样的 杂质，因为病毒颗粒较小，所W能够顺利通过滤纸。 阳〇川 2、过滤后的水样中加入10毫升2. 5mol/L的MgClz,使其终浓度达到0. 05mol/L; 用Imol/L的盐酸调节水样使抑=3. 5 ;然后采用过滤装置使其通过孔径为0. 45ym混合 纤维素醋膜；病毒颗粒在水中带负电荷，阳离子Mg2+和低抑值等条件可W使混合纤维素醋 膜滤膜带正电荷，从而吸附带负电荷的病毒。 3、将病毒吸附在滤膜后，将滤过后的混合纤维素醋膜剪碎并随后放入IOml3%的 牛肉膏浸出液，超声振荡洗脱2min(75w，超声时间和间隔时间均为5s)后3000r/min离屯、 15min后取上清液。牛肉膏浸出液为蛋白类物质，它的抑值比较高。在较高的抑值下，在 超声震荡的作用下，可W同病毒竞争吸附位点，从而使膜上的病毒从滤膜洗脱下来并进入 了上清液。 经第一步浓缩后，500毫升的水中的病毒被浓缩至10毫升上清液中。病毒回收率 58%左右。(二）第二步浓缩（超滤法）将10毫升上清液分批加入IOkd离屯、超滤管（规格：4毫升）对进行超滤，过滤条件为3500转离屯、12min，浓缩后的体积为1. 5ml左右。离屯、超滤管有一个类似于内管和外 管的两个部分，内管中是带有一定分子量的膜，当高速离屯、时，分子量比它小的就漏到下面 的管子（即外管）中了，分子量比它大的就截留在上面（即内管中）。通过第二步浓缩进一 步提高病毒浓缩效率。 阳0%] (S)对浓缩至1. 5ml的样品采用巧光定量RT-PCR方法、普通RT-PCR方法、酶联 免疫吸附测定巧LISA)等方法检测诺如病毒。 实施例2,灵敏性试验 对诺如病毒模拟样品使用微孔滤膜吸附法进行过滤，对其产物使用超滤法进行第 二次浓缩（方法同实施例1)。每个样本浓度相差10倍，计算浓缩的回收率。对诺如病毒模拟 样品使用巧光定量技术计算方法的检测灵敏度，本专利技术对诺如病毒浓缩的灵敏度为3copy/ y1，具体见表1。 表1两步浓缩法对诺如病毒浓缩的灵敏度分析（浓度单位：copy/ y 1) 实施例3本专利技术两步浓缩法同传统浓缩方法的比较 根据文献选取氯化侣絮凝沉淀法、改良氯化巧吸附过滤法两种常见的水中病毒浓 缩方法同本方法进行比较。在水中接种诺如病毒作为模拟样品，浓缩前和浓缩后都进行巧 光定量PCR检测病毒浓度，并计算病毒回收率，结果显示本专利技术的两步浓缩法病毒回收率 最高，结果见表2。 表2 =种病毒浓缩方法病毒回收率比较（浓度单位：copy/y1)阳035] 实施例4本专利技术两步浓缩法的应用 对浙江省余杭区临平镇、乔司镇和塘栖镇=个地方的地表水进行采样，共采集样 品32个，每个样品500ml。应用实施例1的方法对水样进行浓缩，浓缩的样品应用巧光 RT-PCR方法进行诺如病毒检测，检测结果见图1。诺如病毒巧光RT-PCR阳性样品使用两套 普通PCR引物（C0G2F/C0G2R和JV12/JV13)进行普通RT-PCR方法检测（见图2)，然后送上 海吉美生物工程有限公司进行测序。32个样品有12个样品诺如病毒GII型检测阳性，阳性 率37.5% ;测序结果进行比对后证实为诺如病毒。 在取上述样品的同时，在取每个样品的同时再取相同的样品2份，且体积均为 1000ml，获得32个1000 ml的样品两套，分别用氯化侣絮凝沉淀法、改良氯化巧吸附过滤法 运两种传统浓缩方法浓缩，再采用巧光RT-PCR方法进行检侧，无诺如病毒检出。 证明本专利技术检测的高准确性和高灵敏性。【主权项】1.，其特征在于所述检测方法包括以下步骤： (一） 第一步浓缩 (1) 、取水样250ml-1000ml，使用滤纸进行初过滤，去除水样的杂质； (2)、过滤后的水样中加入Mg2+，用盐酸调节水样使pH = 3-4;然后采用过滤装置使水样 通过孔径为0. 45 y m混合纤维素酯膜； (3) 、将滤过后的混合纤维素酯膜剪碎并随后放入IOml牛肉膏浸出液，超声振荡洗脱 后离心，取上清液； (二） 第二步浓缩 将所述上清液分批加入离心超滤管进行高速离心超滤； (三） 对经第二步浓缩后的样品进行诺如病毒的检测。【专利摘要】本专利技术提供了一种，它对样品经混合纤维素酯膜过滤浓缩、将滤过后的硝酸纤维素膜剪碎并随后放入10ml牛肉膏浸出液，超声振荡洗脱后离心，取上清液，将所述上清液分批加入离心超滤管进行高速离心超滤；然后再进行诺如病毒的检测。本专利技术具有极高检测灵敏性和准确度，极大减少取样量，方便检测工作，降低检测成本。【IPC分类】C12Q1/70, C12R1/93, G01N33/569, C12Q1/24, C12Q1/68【公开号】CN105154587【申请号】CN201510552892【专利技术人】宋士利 【申请人】杭州市余杭区疾病预防控制中心【公开日】2015年12月16日【申请日】2015年9月2日本文档来自技高网...

【技术保护点】
水中诺如病毒的检测方法，其特征在于所述检测方法包括以下步骤：（一）第一步浓缩（1）、取水样250ml‑1000ml,使用滤纸进行初过滤，去除水样的杂质；（2）、过滤后的水样中加入Mg2+，用盐酸调节水样使pH＝3‑4；然后采用过滤装置使水样通过孔径为0.45μm混合纤维素酯膜；（3）、将滤过后的混合纤维素酯膜剪碎并随后放入10ml牛肉膏浸出液, 超声振荡洗脱后离心，取上清液；（二）第二步浓缩将所述上清液分批加入离心超滤管进行高速离心超滤；（三）对经第二步浓缩后的样品进行诺如病毒的检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋士利，
申请(专利权)人：杭州市余杭区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33