本发明专利技术公开了一种检测甲型流感病毒的环介导等温扩增通用试剂盒及其应用。本发明专利技术提供的专用引物，包括引物1、引物2、引物3，引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术的专用引物适用于对甲型流感病毒进行特异性检测。本发明专利技术的优点：(1)只需在恒定温度就能扩增反应，不需要特殊设备；(2)特异性高；(3)快速高效，扩增反应在35分钟内即可完成；(4)灵敏度高；(5)鉴定方便简单。本发明专利技术特别适用于基层医疗单位临床标本的快速检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种检测甲型流感病毒的环介导等温扩增通用试剂盒及其应用。
技术介绍
流感病毒属于正黏病毒科，分甲、乙、丙三种型别，甲型和乙型流感对人类威胁较大，其中甲型流感抗原变异频繁，可引起世界性大流行，对人类威胁最大。这类病毒所致疾病的临床表现为起病急、高热、肌痛、头痛伴有严重不适、干咳、咽喉痛，严重时可能导致人死亡，严重威胁人类健康。尤其是流感大流行传播迅速，波及范围广，发病率和死亡率高，严重威胁着人类健康。1918年的HlNl “西班牙流感”、1957年H2N2 “亚洲流感”和1968年H3N2 “香港流感”三次流感大流行导致全球超过5千万人死亡。最近暴发的2009年HlNl流感大流行，全球估计有数亿人感染，至少I万2千余人死亡。流感病毒检测方法的临床意义在很大程度上取决于方法的快速性。对于流感病毒早期快速诊断对于流感流行的防控亦起着至关重要的作用。目前临床应用的流感病毒的检测方法有免疫荧光法、酶免疫测定法、免疫色谱法、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和实时荧光定量PCR技术等。这些方法或者需时较长，或者需要特殊的仪器，难以广泛应用。免疫层析法是近年来发展的一种快速诊断技术，该技术应用免疫胶体金或免疫酶染色可使特定区域显示一定的颜色，从而实现特异性的快速免疫诊断，但灵敏度不高。环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)法具有在等温条件下即可高速、快速、高特异、高灵敏的扩增靶序列的特点。该方法利用4条特异引物在高活性链置换DNA聚合酶作用下，不断大量复制扩增核酸。核酸大量合成时，dNTP会析出大量的焦磷酸根离子，焦磷酸根离子与LAMP体系中的Mg2+(或Mn2+)结合，产生焦磷酸镁或焦磷酸锰沉淀，从而引起反应液的浊度变化，非常易于判断。此外，利用一些荧光燃料，如SYBR green I染料或者与钙黄绿素指示LAMP反应。SYBRgreen I染料可与双链DNA产物结合，当有产物大量扩增时，反应体系呈现显著的荧光信号变化。钙黄绿素在反应初始时与Mn2+结合，反应液显示透明的橙色，当有核酸产物大量合成时，会生成副产物焦磷酸根，使Mg2+游离出来，与钙黄绿素结合，最终使反应液显示微浊的黄绿色。由于LAMP方法试验要求条件低，结果易于判断，非常适宜缺少仪器设备的基层单位或者现场进行流感病毒的筛查。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测甲型流感病毒的专用引物。本专利技术提供的专用引物，包括引物I、引物2、引物3和引物4，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。所述专用引物还包括引物5，所述引物5的核苷酸序列为序列表的序列5。所述专用引物由所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5组成；所述甲型流感病毒具体为甲型流感病毒HlNl亚型A/Beijing/501/2009株。所述专用引物中，F3、B3、FIP、BIP、LB的5’端和/或3’端还可根据靶序列进行延长；所述专用引物中，F3、B3、FIP、BIP、LB还可进行碱基的替换和/或取代，保持3’末端序列6个碱基100%的同源性即可。FIP和BIP中TTTT(下划线者)为连接序列，其长度一般为4个，数目可相应缩短和延长。本专利技术的第二个目的是提供一种检测甲型流感病毒的环介导等温扩 增(LAMP)试剂。本专利技术提供的试剂，包括RNA逆转录酶、Bst DNA聚合酶、2X环介导等温扩增缓冲液、所述的专用引物。所述扩增试剂还包括钙黄绿素；所述扩增试剂由RNA逆转录酶、Bst DNA聚合酶、2X环介导等温扩增缓冲液、所述的专用引物和钙黄绿素组成；所述的专用引物中的引物I和引物2在对应的所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为5pmol/L ;所述的专用引物中的引物3和引物4在对应的所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为40pmol/L ;所述的专用引物中的引物5在对应的所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为20pmol/L ；所述的引物5可与茎环结构结合启动链置换合成，提高扩增效率。扩增的最后产物是具有不同个数的茎环结构、不同长度DNA的混合物，其产量可达10 yg以上，是普通PCR反应DNA产率的至少50倍。所述RNA逆转录酶在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为O. 004U/ μ L ；所述RNA逆转录酶具体为AMV逆转录酶；所述Bst DNA聚合酶在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为O. 32U/ μ L ；所述钙黄绿素在所述环介导等温扩增试剂中的浓度为50 μ mol/L ；所述2X环介导等温扩增缓冲液按照如下方法制备将氯化钾(KCl)、硫酸镁(MgSO4)、硫酸铵((NH4)2SO4)、吐温 20 (Tween-20)、甜菜碱(Betaine)、氯化锰(MnCl2)和dNTPs (脱氧核苷三磷酸混合物dATP、dCTP、dGTP和dTTP)溶于浓度为40mmol/L、PH值为8. 8的Tris盐酸盐缓冲液得到；在所述2 X环介导等温扩增缓冲液中，所述氯化钾的浓度为20mmol/L，所述硫酸镁的浓度为16mmol/L，所述硫酸铵的浓度为20mmol/L，所述吐温20的浓度为O. 2% (质量百分含量)，所述甜菜碱的浓度为I. 6mol/L，所述氯化锰的浓度为lmmol/L，每种所述dNTP的浓度均为2. 8mmol/L0所述甲型流感病毒具体为甲型流感病毒HlNl亚型A/Beijing/501/2009株。本专利技术的第三个目的是提供一种检测甲型流感病毒的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，包括所述的环介导等温扩增试剂；所述甲型流感病毒具体为甲型流感病毒HlNl亚型A/Beijing/501/2009株。所述专用引物或所述的环介导等温扩增试剂在制备用于鉴定和/或辅助鉴定甲型流感病毒的试剂盒中的应用也是本专利技术保护的范围；或所述专用引物或所述的环介导等温扩增试剂或所述的试剂盒在鉴定和/或辅助鉴定甲型流感病毒中的应用也是本专利技术保护的范围。所述甲型流感病毒具体为甲型流感病毒HlNl亚型A/Beijing/501/2009株。本专利技术的第四个目的是提供一种鉴定和/或辅助鉴定待测样品中甲型流感病毒的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤用所述专用引物或所述的环介导等温扩增试剂或所述的试剂盒中的所述专用引物对待测样品进行环介导等温扩增，检测环介导等温扩增反应产物； 所述环介导等温扩增中，以待测样品的RNA为模板；所述环介导等温扩增反应条件为先60°C _65°C反应35-60min，然后75°C 2min终止反应。所述环介导等温扩增反应条件为先63°C反应35min，然后75°C 2min终止反应；所述待测样本为咽拭子或含漱液。本专利技术的检测对象不局限于咽拭子或含漱液，还可涉及动物或人的血清、尸解脏器组织等。所述甲型流感病毒具体为甲型流感病毒HlNl亚型A/Beijing/501/2009株。所述检测环介导等温扩增反应产物的方法为如下I)-3)中的至少一种I)观察所述环介导等温扩增反应产物，若所述产物在自然光下为黄绿色，且在紫外光下有荧光(黄绿色荧光)，则待测样本中含有或者候选含有甲型流感病毒；若所述产物在自然光下为橙黄色，且在紫本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测甲型流感病毒的通用引物，包括引物1、引物2、引物3和引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜涛，刘娟，于学东，秦鄂德，秦成峰，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：
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