本发明专利技术涉及一种具备哺乳动物N-型钙通道抑制功能的活性多肽-蜘蛛抑痛肽-XVI（SPAP-XVI）的鉴定方法。该活性多肽纯化冻干粉为类白色疏松体，极易溶解于水，无气味，水溶液近于无色透明；通过大鼠输精管实验鉴定SPAP-XVI的组织水平生物学活性，发现SPAP-XVI能快速和可逆地抑制低频率电刺激诱导的大鼠输精管收缩，抑制呈浓度依赖性，它的半数有效抑制浓度（IC50）是85±6nM；通过膜片钳电生理实验鉴定SPAP-XVI对钙通道的影响，发现SPAP-XVI抑制大鼠DRG神经元N-型钙通道具有浓度依赖性和时间依赖性，它的IC50值是60±5nM；10µMSPAP-XVI能够迅速抑制N-型电流(τon～28.3±2.3s)。SPAP-XVI能够抑制大鼠DRG神经元上GVIA敏感的N-型钙通道，它的低毒性和可逆性使之有希望成为开发治疗N-型钙通道相关疾病的模板分子。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种具备哺乳动物N-型钙通道抑制功能的活性多肽一蜘蛛抑痛 肽-XVI (SPAP-XVI)的鉴定方法。
技术介绍
钙离子作为细胞内重要的第二信使，对于信号传导、兴奋一收缩藕联、分泌、突 触传递、基因表达调控具有非常重要的作用。电压门控钙通道广泛存在于机体的不同类型 组织细胞中，参与神经、肌肉、分泌、生殖等系统的生理过程。根据电压门控钙通道的电生理 和药理学特征，可将电压门控钙通道分为低阈值（LVA)和高阈值（HVA)两大类。其中低阈 值钙通道主要包括T-型钙通道，高阈值钙通道主要包括有N-型、L-型、P/Q-型和R-型四 类。其中N-型钙通道仅发现存在于神经组织中，主要触发递质的释放，与疼痛的传递密切 相关。蜘蛛产生各种作用于神经系统的神经毒素，其神经毒素根据它们的化学结构分为蛋 白多肽类神经毒素和多胺类神经毒素。其中蜘蛛多肽神经毒素最重要，蜘蛛多肽类神经毒 素根据它们的功能和分子特征可分为两种类型：第一种是低分子量多肽类，它们能与兴奋 性细胞膜上的阳离子通道相互作用；第二种是高分子量多肽类，它们与突触前膜的受体组 分及增强神经介质的分泌作用密切相关。蜘蛛毒液已成为神经毒素的一个重要新来源，而 且蜘蛛毒液中特异性药物和毒素分子也是我们寻找农业杀虫剂的较好模式分子。 SPAP-XVI的分子量约为4437. 4 Da，经序列测定，该多肽的一级结构由39个氨基 酸残基组成，其中含6个半胱氨酸并形成三对二硫键。
技术实现思路
本专利技术旨在于提供一种从蜘蛛毒液中鉴定哺乳动物N-型钙通道抑制剂蜘蛛抑痛 肽-XVI (SPAP-XVI)的方法。其特征在于： (1) 大鼠输精管实验研究SPAP-XVI的组织水平生物学活性：大鼠处死后立即取出长 约2厘米的输精管，并置于预先用95% 02/5% C02饱和的克氏液，轻柔的挤出输精管的内容 物。将输精管的两端分别与34°C恒温的浴槽的底部和换能器相连接，立即将标本置于浴槽 中，通过分布于浴槽两端的电极向输精管施加脉冲电场刺激（波宽：0.14 ms,强度：100 V，周期：15 s)诱导输精管收缩；平衡30 min后进行SPAP-XVI的药理学试验； (2) 膜片钳电生理活性实验检测SPAP-XVI对电压门控钙通道的影响： ①急性分离和原代培养大鼠背根神经节细胞用于膜片钳电生理活性实验；SD大白鼠 处死后，用剪子迅速取出脊椎，再沿与肋骨平面垂直的方向将椎管剪开，并浸泡在盛有少量 细胞培养液的烧杯中；用镊子撕破附在椎管内壁上的一层黏膜，暴露位于椎管和肋骨的交 汇处的背根神经纤维。在胸腰椎段，可挑选16个左右并置入盛有2 mL培养液的培养皿中； 在解剖显微镜下，用维娜斯剪和尖头镊子分离出神经节。剥离包在节外的絮状物和轴索后， 放入盛有约0.5 mL培养液的培养皿中。用吸管吸去液体，将分离好的所有神经节剪碎。剪 碎之后，转入消化液，在34°C、震荡频率110 rpm的环境中进行酶解消化反应20 min ;期间 每隔10 min取出用移液枪吸打数次；向消化液中加入酶的抑制剂，终止酶解处理过程；无 菌操作将消化得到的细胞液转入离心管中进行离心（800 rpm、5 min)，去上清，加入8 mL含 10%小牛血清的长期培养液；重悬细胞后分成3?4皿，放入培养箱（5%C02、95%空气）中， 37°C培养3?4 h贴壁； ②膜片钳电生理活性实验：膜片钳实验要在室温条件下进行，采用全细胞膜片钳技术。 挑选质膜光滑可见、胞质均匀的DRG细胞作为实验细胞；电流记录通过全细胞膜片钳技术 利用放大器EPC9在电脑上进行。玻璃电极管为硼硅酸盐玻璃毛细管。玻璃电极两步拉制 而成，经抛光仪抛光后电极尖端直径约为3 _，充灌电极液后电极电阻为1-3ΜΩ ;实验细 胞形成全细胞记录模式后稳定4?6 min;记录电流经EPC-9放大器10 kHz滤波过滤。线 性漏电流和电容电流用p/4程序予以删除，数据和图形用pulsefit + pulse 8. 0软件采 集分析；实验结果用Sigmaplot9. 0软件进行分析。 本专利技术所述的SPAP-XVI的化学结构式如图1所示，其中C为半胱氨酸，I为异亮 氨酸，G为甘氨酸，E为谷氨酸，V为缬氨酸，P为脯氨酸，D为天冬氨酸，N为天冬酰胺，R为 精氨酸，S为丝氨酸，L为亮氨酸，K为赖氨酸，T为苏氨酸，Η为组氨酸，W为色氨酸，Y为酪 氨酸。 【附图说明】 图1是蜘蛛抑痛肽-XVI的化学结构。 图2是1 μΜ SPAP-XVI对大鼠输精管收缩的影响。1 μΜ SPAP-XVI能快速抑制低 频率电刺激诱导的大鼠输精管收缩，而且这种抑制作用是可逆的。 图3是SPAP-XVI抑制大鼠输精管收缩的浓度依从性。浓效曲线均用Hill方程进 行拟合得出IC5Q。方程y=l-(l-/：axV(l + ([X] /IQ。)，中，z代表毒素浓度，IC5Q代表毒 素半数有效抑制浓度，/?是Hi 11常数。 图4是10 mM SPAP-XVI对低电压激活钙电流的影响。 图5是10 mM SPAP-XVI能明显抑制高电压激活钙电流。 图6是SPAP-XVI不能进一步阻断GVIA-不敏感的电流。 图7是在细胞外液中存在SPAP-XVI时，GVIA不能抑制电流。 图8是MVIIA可阻断部分SPAP-XVI不敏感钙电流。 图9是SPAP-XVI对钙通道电流-电压关系（I-V curve)的影响。 图10是SPAP-XVI抑制N-型钙通道的浓度依赖性。图中每个点的数据来自于5? 8个实验细胞，用平均值土标准误（mean土S. E.)来表示。浓度曲线均用Hill方程进行拟 合得出IC5Q。方程y=l-(l-/maxV(l + ([X] /IC5Qn中，z代表毒素浓度，IC5Q代表毒素半 数有效抑制浓度，~是Hill常数。 图11是SPAP-XVI抑制N-型钙通道的时间依从性。 【具体实施方式】 为了更好的理解和更充分公开本专利技术，下面将通过大鼠输精管实验，大鼠背根神 经节细胞的急性分离和原代培养以及膜片钳电生理活性实验来说明SPAP-XVI的鉴定方 法。 、实验材料和方法 1. 1实验用主要原料 实验用SPAP-XVI是从蜘蛛粗毒中分离纯化而得到，同时通过RP-HPLC和MALDI-T0F 质谱仪鉴定，其纯度为98%以上；SD实验大鼠由中南大学湘雅医学院动物房提供，体重 160-210 g 之间。 1.2大鼠输精管实验： 大鼠输精管标本制备方法：雄性大鼠经断头处死后立即取出长约2厘米的输精管， 并置于预先用 95% 02/5% C02 饱和的克氏液（mM:NaCl 119.0，KC1 4.7，CaCl22.5，MgS041· 2, NaHC03 2.5, ΚΗ2Ρ04 1.2，glucose 11，EDTA 0.026, pH 7.3)中，轻柔的挤出输精管的 内容物。将输精管的两端分别与32°C恒温的5 ml浴槽的底部和换能器连接，立即将标 本置于浴槽中，通过lg砝码定标输精管的拉伸长度。通过分布于浴槽两端的电极向输精 管施加脉冲电场刺激（波宽：0.14 ms，强度：100V，周期本文档来自技高网...
【技术保护点】
本专利技术旨在于提供一种从蜘蛛毒液中鉴定哺乳动物N‑型钙通道抑制剂蜘蛛抑痛肽‑XVI（SPAP‑XVI）的方法，其特征在于：（1）大鼠输精管实验研究SPAP‑XVI 的组织水平生物学活性：大鼠处死后立即取出长约2厘米的输精管，并置于预先用95% O2/5% CO2 饱和的克氏液，轻柔的挤出输精管的内容物；将输精管的两端分别与34ºC恒温的浴槽的底部和换能器相连接，立即将标本置于浴槽中，通过分布于浴槽两端的电极向输精管施加脉冲电场刺激（波宽:0.14 ms，强度：100 V，周期：15 s）诱导输精管收缩；平衡30 min 后进行SPAP‑XVI的药理学试验；（2）膜片钳电生理活性实验检测SPAP‑XVI对电压门控钙通道的影响：①急性分离和原代培养大鼠背根神经节细胞用于膜片钳电生理活性实验：SD大白鼠处死后，用剪子迅速取出脊椎，再沿与肋骨平面垂直的方向将椎管剪开，并浸泡在盛有少量细胞培养液的烧杯中；用镊子撕破附在椎管内壁上的一层黏膜，暴露位于椎管和肋骨的交汇处的背根神经纤维；在胸腰椎段，可挑选16个左右并置入盛有2 mL培养液的培养皿中；在解剖显微镜下，用维娜斯剪和尖头镊子分离出神经节；剥离包在节外的絮状物和轴索后，放入盛有约0.5 mL培养液的培养皿中；用吸管吸去液体，将分离好的所有神经节剪碎；剪碎之后，转入消化液，在34℃、震荡频率110 rpm的环境中进行酶解消化反应20 min；期间每隔10 min取出用移液枪吸打数次；向消化液中加入酶的抑制剂，终止酶解处理过程；无菌操作将消化得到的细胞液转入离心管中进行离心（800 rpm、5 min），去上清，加入8 mL含10%小牛血清的长期培养液；重悬细胞后分成3～4皿，放入培养箱（5%CO2、95%空气）中，37℃培养3～4 h贴壁；②膜片钳电生理活性实验：膜片钳实验要在室温条件下进行，采用全细胞膜片钳技术；挑选质膜光滑可见、胞质均匀的DRG细胞作为实验细胞；电流记录通过全细胞膜片钳技术利用放大器EPC9在电脑上进行；玻璃电极管为硼硅酸盐玻璃毛细管；玻璃电极两步拉制而成，经抛光仪抛光后电极尖端直径约为3 mm，充灌电极液后电极电阻为1‑3 MΩ；实验细胞形成全细胞记录模式后稳定4～6 min；记录电流经EPC‑9放大器10 kHz 滤波过滤；线性漏电流和电容电流用p/4程序予以删除, 数据和图形用pulsefit + pulse 8.0 软件采集分析；实验结果用Sigmaplot9.0软件进行分析。...
【技术特征摘要】
1.本发明旨在于提供一种从蜘蛛毒液中鉴定哺乳动物N-型钙通道抑制剂蜘蛛抑痛 肽-XVI (SPAP-XVI)的方法，其特征在于： (1) 大鼠输精管实验研究SPAP-XVI的组织水平生物学活性：大鼠处死后立即取出长 约2厘米的输精管，并置于预先用95% 02/5% C02饱和的克氏液，轻柔的挤出输精管的内容 物；将输精管的两端分别与34° C恒温的浴槽的底部和换能器相连接，立即将标本置于浴槽 中，通过分布于浴槽两端的电极向输精管施加脉冲电场刺激(波宽：0.14 ms,强度：100 V， 周期：15 s)诱导输精管收缩；平衡30 min后进行SPAP-XVI的药理学试验； (2) 膜片钳电生理活性实验检测SPAP-XVI对电压门控钙通道的影响： ① 急性分离和原代培养大鼠背根神经节细胞用于膜片钳电生理活性实验：SD大白鼠 处死后，用剪子迅速取出脊椎，再沿与肋骨平面垂直的方向将椎管剪开，并浸泡在盛有少量 细胞培养液的烧杯中；用镊子撕破附在椎管内壁上的一层黏膜，暴露位于椎管和肋骨的交 汇处的背根神经纤维；在胸腰椎段，可挑选16个左右并置入盛有2 mL培养液的培养皿中； 在解剖显微镜下，用维娜斯剪和尖头镊子分离出神经节；剥离包在节外的絮状物和轴索后， 放入盛有约0...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓梅春，罗旋，
申请(专利权)人：长沙沁才生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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