本发明专利技术涉及一种TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法,通过该筛选方法筛选出简便易行的TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂壳寡糖作为TMEM16A钙激活氯离子通道筛选实验的阳性对照物，壳寡糖可以筛选其他可作为TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂的药物，为研究TMEM16A/CaCCs激活剂在治疗高血压、CF病、哮喘、胃肠动力学障碍疾病和某些类型的肿瘤等疾病中的应用提供基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，特别涉及一种TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法。
技术介绍
I丐激活氯离子通道(Calcium-activated Chloride Channels, CaCCs)由于被细胞内部钙离子所激活而得名，最早发现于非洲爪蟾卵母细胞中，随后相继有报道表明上皮细胞、血管内皮细胞、神经元、平滑肌与心肌细胞中都存在。钙离子介导的信号转导途径是真核生物信号转导的重要组成部分，因此CaCCs执行多种功能，包括卵细胞的受精、跨上皮离子/液体转运、心肌细胞复极化和动作电位发生、嗅觉传导及平滑肌伸缩的调节等。由于技术的原因，CaCCs的分子基础问题一直未能解决，导致相关药理学研究进程极为缓慢。直到2008年底，有三个研究小组独立报道CaCCs的分子基础是跨膜蛋白16A(transmembrane 16A,简称 TMEM16A)(Schroeder BC 等，Cell, 2008，134:1019-1029;CaputoA 等，Science, 2008，322:590-594; Yang YD 等，Nature, 2008，455:1210-1215)。这一发现为在特定细胞和组织中研究CaCCs的生理学和药理学等方面的问题提供了新的研究平台。最近发现TMEM16A通道与多种重大疾病密切相关。文献报道，TMEM16A离子通道可能是肺囊性纤维化(CF)疾病的药物靶点，激活TMEM16A通道可起到补偿上皮组织上氯离子通道囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator，简称CFTR)基因突变所致的离子/液体转运不平衡(Rock JR等，J. Biol.Chem.，2009，284:14875-14880)。 另外，2012 年，Wang 等(Wang M 等，Circulation,2012，125:697-707)证明TMEM16A是脑血管平滑肌细胞CaCCs的分子基础，并且发现TMEM16A离子通道的活性与血压呈负相关。另一方面，CaCCs的抑制剂被报道可用于治疗哮喘、胃肠动力学障碍疾病和某些类型的肿瘤等。由此可见，筛选TMEM16A离子通道特异性调节剂可为CaCCs相关疾病的治疗提供新的药物靶点。美国生命科学技术公司Invitrogen 的试剂盒Premo 卤化物传感器运用黄色突光蛋白(Yellow Fluorescence Protein, YFP)的三突变体蛋白质YFP-F46L/H148Q/I152L的荧光作为指标，筛选CaCCs/TMEM16A离子通道的调节剂。运用此方法，2010年，Namkung等(Namkung W 等，The FASEBJ.，2010, 24:4178-4186)应用 Premo 卤化物传感器试剂盒筛选得到单宁酸(tannic acid)及相关的没食子单宁(gallotannin)为TMEM16A/CaCCs的抑制剂。遗憾的是，目前缺乏简便易行的TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂作为以上筛选实验的阳性对照物，来为研究TMEM16A/CaCCs在高血压、CF病、哮喘、胃肠动力学障碍疾病和某些类型的肿瘤等疾病中的应用提供基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法，通过该筛选方法筛选出简便易行的TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂作为TMEM16A钙激活氯离子通道筛选实验的阳性对照物，来为研究TMEM16A/CaCCs在高血压、CF病、哮喘、胃肠动力学障碍疾病和某些类型的肿瘤等疾病中的应用提供基础。本专利技术提供了一种TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法，包括如下步骤(a)将TMEM16A质粒稳定转染入哺乳动物细胞HEK293细胞；(b)将黄色荧光蛋白YFP三突变体YFP-F46L/H148Q/I152L导入步骤(a)中的稳定转染TMEM16A钙激活氯离子通道的HEK293细胞；(C)将候选药物与步骤(b)所述的导入后的细胞进行孵育，再加入含有碘离子的溶液观察，其中若荧光强度减弱，表明所述候选药物可能为TMEM16A钙激活氯离子通道的激活剂，并采用步骤(d)进行进一步验证； (d)使用电生理学方法测定所述候选药物对步骤(a)中电流的影响，其中若加入所述候选药物后电流比对照增大，则确定该候选药物是TMEM16A钙激活氯离子通道的激活齐U，若电流比对照没有增大，则确定该候选药物不是TMEM16A钙激活氯离子通道的激活剂。进一步优选，所述的步骤(b)中，YFP三突变体YFP-F46L/H148Q/I152L由杆状病毒载体导入细胞。进一步优选，步骤(C)中所述的电生理学测定方法为膜片钳技术。进一步优选，步骤(d)中所述的荧光强度由激光显微镜检测，其中激发光波长为470-540nm，检测波长为 540_590nm。进一步优选，所述候选药物为壳寡糖或其他TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂。采用本专利技术所述的筛选方法能够简便易行地筛选出的TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂，作为TMEM16A钙激活氯离子通道筛选实验的阳性对照物，来筛选对TMEM16A钙激活氯离子通道有激活作用的药物分子，可开发成为治疗TMEM16A/CaCCs在高血压、CF病、哮喘、胃肠动力学障碍疾病和某些类型的肿瘤等疾病的药物。附图说明图I :根据本专利技术所述内面向外模式下转染有TMEM16A钙激活氯离子通道的HEK293细胞在不同浓度壳寡糖作用下电流增大的趋势图。图2 :根据本专利技术所述内面向外模式下未经TMEM16A钙激活氯离子通道转染的HEK293细胞在不同浓度游离钙离子及壳寡糖的作用下电流无明显变化的趋势图。图3 :根据本专利技术所述不同浓度壳寡糖作用下转染有TMEM16A钙激活氯离子通道的HEK293细胞以及未转染外源基因的HEK293细胞的电流-电压曲线图。图4 :根据本专利技术所述TMEM16A离子通道激活剂壳寡糖对黄色荧光蛋白的荧光强度的增强作用趋势图。具体实施例方式本专利技术提供了一种TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法，包括如下步骤(a)将TMEM16A质粒稳定转染入哺乳动物细胞HEK293细胞；(b)将黄色荧光蛋白YFP三突变体YFP-F46L/H148Q/I152L导入步骤(a)中的稳定转染TMEM16A钙激活氯离子通道的HEK293细胞；(C)将候选药物与步骤(b)所述的导入后的细胞进行孵育，再加入含有碘离子的溶液观察，其中若荧光强度减弱，表明所述候选药物可能为TMEM16A钙激活氯离子通道的激活剂，并采用步骤(d)进行进一步验证；(d)使用电生理学方法测定所述候选药物对步骤(a)中电流的影响，其中若加入所述候选药物后电流比对照增大，则确定该候选药物是TMEM16A钙激活氯离子通道的激活齐U，若电流比对照没有增大，则确定该候选药物不是TMEM16A钙激活氯离子通道的激活剂。可用于本专利技术筛选方法的细胞没有特别限制，代表性的例子包括哺乳动物细胞，如HEK293细胞，CHO细胞或脊椎动物非洲爪蟾(Xenopus Iaevis)卵母细胞。可用于本专利技术筛选方法的电生理学测定方法没有特别限制。代表性的例子包括 膜片钳法(用于哺乳动物细胞)、或双电极本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法,其特征在于，包括如下步骤：（a）将TMEM16A质粒稳定转染入哺乳动物细胞HEK293细胞；（b）将黄色荧光蛋白YFP三突变体YFP？F46L/H148Q/I152L导入步骤（a）中的稳定转染TMEM16A钙激活氯离子通道的HEK293细胞；（c）将候选药物与步骤（b）所述的导入后的细胞进行孵育，再加入含有碘离子的溶液观察，其中若荧光强度减弱，表明所述候选药物可能为TMEM16A钙激活氯离子通道的激活剂,并采用步骤（d）进行进一步验证；（d）使用电生理学方法测定所述候选药物对步骤（a）中电流的影响，其中若加入所述候选药物后电流比对照增大，则表明所述候选药物确定为TMEM16A钙激活氯离子通道的激活剂,若电流比对照没有增大，则确定该候选药物不是TMEM16A钙激活氯离子通道的激活剂。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：展永，陈娅斐，郭鹏，安海龙，耿金鹏，王晖，袁宏博，赵小明，杜昱光，
申请(专利权)人：河北工业大学，
类型：发明
国别省市：
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