一种流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和鉴定方法，属于生物制药技术领域。本发明专利技术是研究和开发了一种通过构建和筛选病毒基因由Mu噬菌体转座子介导的高密度随机插入突变体库，获得弱毒活疫苗候选毒株的方法，并开发了一套对所获得的弱毒活疫苗毒株进行系统性评价的技术体系。这些方法不但可以直接应用于流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和评价，而且对于其他病毒弱毒活疫苗的研制和开发有广泛的借鉴意义。

Screening and identification of a attenuated live vaccine strain of influenza virus

The invention relates to a screening and identification method of influenza virus attenuated live vaccine strain, belonging to the technical field of biological pharmacy. The present invention is a research and development through the construction and screening of virus gene by phage Mu transposon mediated high density random insertion mutant library for live attenuated vaccine candidate strain, and developed a set of the live attenuated vaccine strain technology evaluation system. These methods can be applied not only to the screening and evaluation of influenza virus attenuated live vaccine strains, but also to the development and development of other virus attenuated live vaccines.

【技术实现步骤摘要】
一种流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和鉴定方法
本专利技术涉及一种流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和鉴定方法，属于生物制药

技术介绍
流感是一种严重威胁人类健康和公共卫生安全的呼吸道传染病。当前防治流感的主要方法是患者应用抗病毒药物进行治疗和对正常人群进行免疫接种。但是由于近些年来流行的流感病毒都具有普遍的耐药性，使得目前使用的抗流感病毒药物的疗效非常有限，流感的治疗面临无药可用的局面。因此疫苗接种已成为当前流感防治体系中最为基础和有效手段。目前使用的流感疫苗有两种，一种为流感病毒灭活疫苗，另一种为流感病毒减毒活疫苗。中国使用的是流感灭活疫苗。传统的灭活疫苗都是利用鸡胚作为生产基质，这使得其应用面临诸多问题。首先，由鸡胚生产的流感疫苗中会残存一些鸡胚的成分，这些成分往往造成疫苗接种者出现比较严重的副反应，这使得某些人群根本无法接种流感疫苗；为了降低疫苗接种的副反应，现在要经过复杂的纯化过程去除鸡胚蛋白，而这又增加了疫苗生产的时间和经济成本。其次，目前所使用的灭活疫苗对于婴幼儿及老年人的免疫效果不是很好，而其主要原因可能是鸡胚疫苗中的异源性抗原分散了这些人群机体有限的免疫应答能力，另外也与禽类和人类细胞在抗原微修饰方面的差异有关。此外，当一种新型流感病毒出现后，利用当前疫苗的鸡胚生产体系一般需要将近6个月的时间才能生产出新的疫苗，这常使得我们无法在面临流感流行或大流行的时候及时生产和储备足够量的疫苗。而且某些流禽流感病毒由于其对鸡胚的高度致死性，可能根本就无法通过鸡胚来生产该类病毒的疫苗。流感减毒活疫苗由于其在介导细胞免疫和粘膜免疫方面的优势特点，它能给人体提供非常好的免疫保护效果。这些冷适应减毒疫苗是将野生型流感病毒在非病毒生理条件下进行持续的传代，使病毒在冷适应的过程中获得某种突变，进而从突变的病毒中筛选出能够作为弱毒活疫苗的毒株。这种方法非常的耗时，冷适应能获得的突变病毒量非常有限，导致在候选筛选过程中的可选择性很小。另外。冷适应获得的突变病毒，往往是在病毒的基因组发生一个或若干个点突变，这种突变在后续疫苗生产和免疫过程中非常容易发生回复性突变，可能造成疫苗的返祖，进而引起疾病。尽管如此，现有的冷适应减毒疫苗都是由国外相关单位所研发，我国还没有自己独立知识产权的减毒疫苗毒株，这在一定程度上阻碍了流感病毒减毒活疫苗在中国的生产和应用。由此可见，发展新的流感减毒活疫苗筛选和评价体系，开发具有自主知识产权的减毒疫苗毒株，克服传统弱毒疫苗研制体系缺陷是应对当前严峻的流感防控形势迫切需求，也具有很高的经济价值。
技术实现思路
本专利技术是研究和开发了一种通过构建和筛选病毒基因由Mu噬菌体转座子介导的高密度随机插入突变体库，获得弱毒活疫苗候选毒株的方法，并开发了一套对所获得的弱毒活疫苗毒株进行系统性评价的技术体系。这些方法不但可以直接应用于流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和评价，而且对于其他病毒弱毒活疫苗的研制和开发有广泛的借鉴意义。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：(1)利用Mu噬菌体转座子介导的随机插入技术建立M基因的高密度突变库：利用Finnzymes公司Mu噬菌体转座子介导的随机插入突变试剂盒向流感病毒A/WSN/1933M基因各个碱基间插入5’-NNNNNTGCGGCCGCA-3’这一15nt长的寡核苷酸序列，从而获得流感病毒M基因的高密度突变库；(2)通过流感病毒反向遗传学技术获得病毒突变体库：用电转化的方法将携有M基因突变体的质粒转化入大肠杆菌DH10B感受体细胞，从重组菌种提取M基因突变体库质粒，然后利用A/WSN/33H1N1流感病毒8质粒病毒反向遗传学操作系统获取病毒突变体库；(3)通过第二代测序技术对病毒突变体库组分进行分析：取步骤(2)获得的病毒突变体库病毒在MDCK细胞上进行传代，然后利用TRIzol试剂提取病毒RNA，并对各RNA按照反转录试剂盒iScriptTMcDNASynthesiskit进行反转录产生相应的cDNA，以该cDNA为模板，分别使用3个M基因的特异性正向引物5’-AGCAAAAGCAGGTAGATATT-3’，5’-GGGGCCAAAGAAATAGCACT-3’，5’-TCCTAGCTCCAGTGCTGGTC-3’与Vic标记的插入序列特异性反向引物做PCR扩增，由PCR获得的荧光标记PCR产物设置一次重复和Liz-500分子量标准利用96-毛细管3730xlDNA分析仪进行测序，所产生的数据应用ABI软件依照以下标准进行分析，去除PCR过程、引物及测序仪器产生的非特异性数据；(4)小鼠体内筛选流感病毒弱毒活疫苗候选毒株：首先通过超速离心的方法浓缩突变体库病毒，测定其病毒滴度后用于后续小鼠感染实验，病毒通过滴鼻的方法感染6-8周龄的C57/B6小鼠，分别在感染后第二天、第四天、第六天和第八天收取小鼠的肺脏组织并进行匀浆处理，从肺组织匀浆中用TRIzol试剂提取总RNA，依照上述步骤(3)的方法对样本中病毒M基因进行测序并进行定性和定量分析，根据不同M基因突变病毒在各样本中的存在情况，确定弱毒活疫苗候选毒株；(5)弱毒活疫苗候选毒株遗传稳定性和安全性评价：(a)弱毒活疫苗的分离和表型鉴定：首先对上述弱毒活疫苗候选毒株进行了单克隆化，对其中能在MDCK细胞中能够有效复制的W7-757、W7-791和W7-797三株病毒进行扩增，筛选出表现出更好的复制能力和较低的细胞毒性的W7-791病毒；(b)弱毒活疫苗遗传稳定性检测：将W7-791病毒在MDCK细胞和小鼠体内进行传代，对从细胞或小鼠肺脏匀浆中获得病毒的基因序列中的M基因的序列进行测定，确定W7-791病毒M基因的突变能够被稳定地遗传下去；(c)弱毒疫苗的安全性评估：用不同滴度的W7-791病毒免疫6-8周龄小鼠，没发现小鼠产生体重下降及流感症状；给15日龄的新生BALB/c小鼠滴鼻接种不同滴度的W7-791或104TCID50的野生型WSN病毒，对小鼠体重和肺脏病变进行检测，W7-791接种小鼠上未观察到像野生型WSN病毒感染小鼠那样的体重下降和肺部病变，由此确定W7-791病毒即为流感病毒弱毒活疫苗毒株。进一步地，步骤(2)中的电转化的条件是2.0kV、200Ω、25μF。进一步地，步骤(2)中获取病毒突变体库的具体方法是：培养的HEK293T细胞转至6孔培养板中，待细胞汇合度达到80～90％时，按照转染试剂操作说明，将含插入突变M基因的质粒和含有流感病毒其他7个基因片段的质粒等量混合，与转染试剂按比例混匀，室温孵育15min，逐滴加入HEK293T细胞培养液中，37℃，5％CO2培养箱中培养48h，收集转染细胞上清，并将病毒接种于MDCK细胞上进行扩增，感染48小时后收集病毒，将部分病毒冻存以备后用。进一步地，步骤(3)中PCR使用Novagen的PCR酶KODHot-Startpolymerase，PCR的反应条件是预变性95℃，10min；变性95℃，45s；退火52℃，30s；延伸72℃，90s；运行30个循环；最后72℃延伸10min。进一步地，步骤(3)中去除非特异性数据的方法为：(a)所有数据都满足标准的默认检测水平；(b)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：(1) 利用Mu噬菌体转座子介导的随机插入技术建立M基因的高密度突变库：利用Finnzymes公司Mu噬菌体转座子介导的随机插入突变试剂盒向流感病毒A/WSN/1933的M基因各个碱基间插入5’‑NNNNNTGCGGCCGCA‑3’这一15nt长的寡核苷酸序列，从而获得流感病毒M基因的高密度突变库；(2) 通过流感病毒反向遗传学技术获得病毒突变体库：用电转化的方法将携有M基因突变体的质粒转化入大肠杆菌DH10B感受体细胞，从重组菌种提取M基因突变体库质粒，然后利用A/WSN/33 H1N1流感病毒8质粒病毒反向遗传学操作系统获取病毒突变体库；(3) 通过第二代测序技术对病毒突变体库组分进行分析：取步骤(2)获得的病毒突变体库病毒在MDCK细胞上进行传代，然后利用TRIzol试剂提取病毒RNA，并对各RNA按照反转录试剂盒iScriptTM cDNA Synthesis kit进行反转录产生相应的cDNA，以该cDNA为模板，分别使用3个M基因的特异性正向引物，其序列分别为SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，与Vic标记的插入序列特异性反向引物做PCR扩增，由PCR获得的荧光标记PCR产物设置一次重复和Liz‑500分子量标准利用96‑毛细管3730xl DNA分析仪进行测序，所产生的数据应用ABI软件进行分析，去除PCR过程、引物及测序仪器产生的非特异性数据；(4) 小鼠体内筛选流感病毒弱毒活疫苗候选毒株：首先通过超速离心的方法浓缩突变体库病毒，测定其病毒滴度后用于后续小鼠感染实验，病毒通过滴鼻的方法感染6‑8周龄的C57/B6小鼠，分别在感染后第二天、第四天、第六天和第八天收取小鼠的肺脏组织并进行匀浆处理，从肺组织匀浆中用TRIzol试剂提取总RNA，依照上述步骤（3）中方法对样本中病毒M基因进行测序并进行定性和定量分析，根据不同M基因突变病毒在各样本中的存在情况，确定弱毒活疫苗候选毒株；(5) 弱毒活疫苗候选毒株遗传稳定性和安全性评价：（a）弱毒活疫苗的分离和表型鉴定：首先对上述弱毒活疫苗候选毒株进行了单克隆化，对其中能在MDCK细胞中能够有效复制的W7‑757、W7‑791和W7‑797三株病毒进行扩增，初步筛选出表现出更好的复制能力和较低的细胞毒性的W7‑791病毒；（b）弱毒活疫苗遗传稳定性检测：将W7‑791病毒在MDCK细胞和小鼠体内进行传代，对从细胞或小鼠肺脏匀浆中获得病毒的基因序列中的M基因的序列进行测定， 确定W7‑791病毒M基因的突变能够被稳定地遗传下去；（c）弱毒疫苗的安全性评估：用不同滴度的W7‑791病毒免疫6‑8周龄小鼠，没发现小鼠产生体重下降及流感症状；给15日龄的新生BALB/c小鼠滴鼻接种不同滴度的W7‑791或10...

【技术特征摘要】
1.一种流感病毒弱毒活疫苗毒株的筛选和鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：(1)利用Mu噬菌体转座子介导的随机插入技术建立M基因的高密度突变库：利用Finnzymes公司Mu噬菌体转座子介导的随机插入突变试剂盒向流感病毒A/WSN/1933的M基因各个碱基间插入5’-NNNNNTGCGGCCGCA-3’这一15nt长的寡核苷酸序列，从而获得流感病毒M基因的高密度突变库；(2)通过流感病毒反向遗传学技术获得病毒突变体库：用电转化的方法将携有M基因突变体的质粒转化入大肠杆菌DH10B感受体细胞，从重组菌种提取M基因突变体库质粒，然后利用A/WSN/33H1N1流感病毒8质粒病毒反向遗传学操作系统获取病毒突变体库；(3)通过第二代测序技术对病毒突变体库组分进行分析：取步骤(2)获得的病毒突变体库病毒在MDCK细胞上进行传代，然后利用TRIzol试剂提取病毒RNA，并对各RNA按照反转录试剂盒iScriptTMcDNASynthesiskit进行反转录产生相应的cDNA，以该cDNA为模板，分别使用3个M基因的特异性正向引物，其序列分别为SEQIDNo.2，SEQIDNo.3，SEQIDNo.4，与Vic标记的插入序列特异性反向引物做PCR扩增，由PCR获得的荧光标记PCR产物设置一次重复和Liz-500分子量标准利用96-毛细管3730xlDNA分析仪进行测序，所产生的数据应用ABI软件进行分析，去除PCR过程、引物及测序仪器产生的非特异性数据；(4)小鼠体内筛选流感病毒弱毒活疫苗候选毒株：首先通过超速离心的方法浓缩突变体库病毒，测定其病毒滴度后用于后续小鼠感染实验，病毒通过滴鼻的方法感染6-8周龄的C57/B6小鼠，分别在感染后第二天、第四天、第六天和第八天收取小鼠的肺脏组织并进行匀浆处理，从肺组织匀浆中用TRIzol试剂提取总RNA，依照上述步骤（3）中方法对样本中病毒M基因进行测序并进行定性和定量分析，根据不同M基因突变病毒在各样本中的存在情况，确定弱毒活疫苗候选毒株；(5)弱毒活疫苗候选毒株遗传稳定性和安全性评价：（a）弱毒活疫苗的分离和表型鉴定：首先对上述弱毒活疫苗候选毒株进行了单克隆化，对其中能在MDCK细胞中能够有效...

【专利技术属性】
技术研发人员：程根宏，
申请(专利权)人：苏州系统医学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32