用于检测结直肠癌的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于检测结直肠癌的试剂盒，包括寡核苷酸预混液I组中核苷酸序列，所述核苷酸序列包括SEQ ID NO.01、SEQ ID NO.02、SEQ ID NO.03、SEQ ID NO.04、SEQ ID NO.05、SEQ ID NO.06、SEQ ID NO.07、SEQ ID NO.08、SEQ ID NO.09、SEQ ID NO.10。本发明专利技术可实现结直肠癌的诊断，具有灵敏度高、特异性好、检测时间短、普及度高、检测结果稳定的优势。

A Kit for Detecting Colorectal Cancer and Its Application

The invention discloses a kit for detecting colorectal cancer, including nucleotide sequences in group I of oligonucleotide premix solution, which include SEQ ID NO.01, SEQ ID NO.02, SEQ ID NO.03, SEQ ID NO.04, SEQ ID NO.05, SEQ ID NO.06, SEQ ID NO.07, SEQ ID NO.08, SEQ ID NO.09, SEQ ID NO.10. The invention can realize the diagnosis of colorectal cancer, and has the advantages of high sensitivity, good specificity, short detection time, high popularity and stable detection results.

【技术实现步骤摘要】
用于检测结直肠癌的试剂盒及其应用
本专利技术属于肿瘤学生物检测领域，尤其涉及用于检测结直肠癌的试剂盒及其应用。
技术介绍
结直肠癌(CRC)是当今最常见的疾病之一，每年全球有约120万名患者被确诊为结直肠癌，而有超过60万名患者直接或间接死于结直肠癌。结直肠癌的发病率会随着年龄的增大而增加，比如发达国家的结直肠癌发病中位年龄为70岁。我国结直肠癌发病率及死亡率呈总体增高趋势，结直肠癌在10年间的发病率表现为明显升高趋势，而在死亡率方面，男性患者同样表现为逐年上升趋势，而女性患者则相对趋于平稳。2015年我国约有281.4万人死于癌症，结直肠癌在男性和女性中死亡率为第五位。I期大肠癌的5年生存率超过90％，二期的80％左右，三期的也有60％左右，但如果到了第IV期，5年生存率只有10％。而大肠癌的复发几率与确诊时的分期具相关性，一般，越是早期发现的大肠癌，治疗后复发率就会越低。在生存期方面，I期患者的5年生存率可达90％以上，而IV期患者只有略大于10％的5年生存率。肿瘤复发和转移是结直肠癌患者的主要死亡原因，目前临床暂无明显有效的治疗措施，预防结直肠癌治疗后的复发或转移，治疗后规范的辅助化疗和放疗可以减少大肠癌的复发转移或延长复发转移的时间，但并不能完全避免肿瘤的复发甚至转移，因此一般临床医生会建议病人定期检查。同时结直肠癌CRC有着较高的复发率，实施根治术后，有50％的复发可能，结直肠癌治疗后两年内复发率最高，因此临床大夫建议患者每3-6个月复查一次，两年后改为半年一次一直持续到第3年。目前结直肠癌发生或复发检测的方法及其相关特点包括如下所述：(1)便隐血试验(FecalOccultBloodTest，FOBT)：具有方便、无创、患者接受度高等优点，但其检验结果的假阳性率及假阴性率均较高，易造成漏检或错检；(2)全结肠镜/乙状结肠镜检查：是目前诊断/复发检测的金标准检查方法，其检验结果的敏感性和特异性均较高，但部分患者检查过程需要麻醉或镇静，且检查中可能出现出血、穿孔等并发症(0.1％)，这些检查过程的不适以及检查的禁忌症使得很多患者对接受结肠镜检查心有疑虑，并且作为大规模结直肠癌早期筛查方法来讲，耗费的社会医疗资源将过于巨大；(3)CEA、CA99等血清常规肿瘤标志物：现今被广泛使用与肿瘤辅助诊断、复发监控，检测灵敏度较低；(4)PET-CT检查:对于病情复杂、常规检查无法明确诊断的患者可作为有效的辅助检查。术前检查提示为Ⅲ期以上肿瘤，为了解有无远处转移使用；(5)经直肠腔内超声检查、B型超声、CT、MRI：为常规检测，具有方便快捷的优越性；明确病变侵犯肠壁的深度，向壁外蔓延的范围和远处转移的部位。现有研究发现癌细胞在破裂和死亡时，会释放出循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA，ctDNA)。游离循环肿瘤DNA是一种胞外DNA，主要存在于血液(血清或血浆)、滑膜液和脑脊液等体液中。ctDNA释放入血的机制目前仍无定论，现在普遍认为细胞的凋亡和坏死为血液内ctDNA的主要来源。近年来，大量ctDNA检测在肿瘤诊断、治疗中的研究被报道。EpigenomicsAG公司的Septin9基因甲基化检测试剂盒EpiproColon2.0为结直肠癌辅助诊断提供了一个良好的检测手段，但是存在检测血量太大，检测灵敏度较低的问题。综上所述，仍有必要提供一种的待测样本血量少、灵敏度高的基因甲基化检测试剂盒。
技术实现思路
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的是提出一种用于检测结直肠癌的试剂盒。本专利技术以检测血浆ctDNA发现结直肠癌发生的方法，通过对循环肿瘤DNA(ctDNA)甲基化异常高灵敏度检测，可同时对多个结直肠癌标记物的甲基化异常进行分析，对ctDNA甲基化异常有低至0.1％的检测灵敏度，可实现肿瘤的早期发现、复发的实时监控，具有灵敏度高、特异性好、检测时间短、普及度高、检测结果稳定的优势。本专利技术的目的将通过以下技术方案得以实现：用于检测结直肠癌的试剂盒，包括寡核苷酸预混液I组中核苷酸序列，所述核苷酸序列SEQIDNO.01、SEQIDNO.02、SEQIDNO.03、SEQIDNO.04、SEQIDNO.05、SEQIDNO.06、SEQIDNO.07、SEQIDNO.08、SEQIDNO.09、SEQIDNO.10。在一些实施例中，还包括包括寡核苷酸预混液II组中核苷酸序列，所述核苷酸序列包括包括SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17、SEQIDNO.08、SEQIDNO.09、SEQIDNO.10。在一些实施例中，还包括游离DNA甲基化溶剂。在一些实施例中，还包括PCR检测预混液、PCR检测核苷酸预混液、质控品试剂；所述PCR检测核苷酸预混液包括PCR检测核苷酸预混液I和PCR检测核苷酸预混液II；所述PCR检测核苷酸预混液I包括所述第一组核苷酸序列，所述PCR检测核苷酸预混液II包括所述第二组核苷酸序列。在一些实施例中，所述核苷酸序列SEQIDNO.04的3’端带有间壁3修饰；所述核苷酸序列SEQIDNO.04的第16、23、25、32位腺嘌呤核苷酸带有锁核酸修饰。锁核酸修饰可以增加阻遏片段(blocker)对于模板的结合能力，使得阴性模板更易被阻遏。在一些实施例中，所述核苷酸序列SEQIDNO.15的3’端带有间壁3修饰；所述核苷酸序列SEQIDNO.15的第4、8、11、21位腺嘌呤核苷酸带有锁核酸修饰。在一些实施例中，所述游离DNA甲基化溶剂包括亚硫酸氢盐修饰试剂、DNA保护液、脱磺液、漂洗液、洗脱液、和/或氧化硅磁珠悬浮液。在一些实施例中，所述PCR检测预混液包括聚合酶缓冲液、Taq聚合酶、二价阳离子、和/或dNTPs。在一些实施例中，所述质控品包括阳性质控品、阴性质控品、和/或空白质控品。在一些实施例中，所述阳性质控品包括人工模拟血浆、和/或HCT116细胞系DNA；所述阴性质控品包括人工血浆、和/或HCT116细胞系DNA；所述空白质控品包括人工模拟血浆。一种根据上述任意一项所述的试剂盒在结直肠癌诊断、结直肠癌实时监测或术后复发诊断中的应用。在一些实施例中，采用Q-PCR检测法进行检测，所述Q-PCR检测法为三重PCR检测的组合方式。在一些实施例中，所述三重PCR检测的组合方式包括：检测管I为SEPTIN9、BCAT1、和ACTB；和/或检测管II为IKZF1、SDC2、ACTB。在一些实施例中，采用PCR检测的荧光信号为三个通道，所述三个通道采集的荧光信号分别为513nm-523nm、543nm-553nm、和662nm-672nm。与现有技术相比，本专利技术提供的用于检测结直肠癌的试剂盒及其应用，达到的技术效果是：(1)本专利技术的试剂盒可以用于结直肠癌的早期检测、或术后复发检测；(2)假阳性率低：蛋白质标记血液含量在非肿瘤的病理或生理条件下也有可能升高，而本专利技术试剂盒的靶标只有在癌变和癌前病变的细胞存在时才会出现，假阳性几率低；(3)能够实时反映肿瘤的动态：大多数蛋白质生物标识能在血液中存在数周，而ctDNA的半衰期不到两个小时，因此本专利技术检测试剂盒可呈现肿本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于，包括寡核苷酸预混液I组中核苷酸序列，所述核苷酸序列包括SEQ ID NO.01、SEQ ID NO.02、SEQ ID NO.03、SEQ ID NO.04、SEQ ID NO.05、SEQ ID NO.06、SEQ ID NO.07、SEQ ID NO.08、SEQ ID NO.09、SEQ ID NO.10。

【技术特征摘要】
1.用于检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于，包括寡核苷酸预混液I组中核苷酸序列，所述核苷酸序列包括SEQIDNO.01、SEQIDNO.02、SEQIDNO.03、SEQIDNO.04、SEQIDNO.05、SEQIDNO.06、SEQIDNO.07、SEQIDNO.08、SEQIDNO.09、SEQIDNO.10。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括寡核苷酸预混液II组中核苷酸序列，所述核苷酸序列包括SEQIDNO.08、SEQIDNO.09、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括游离DNA甲基化溶剂。4.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR检测预混液、PCR检测核苷酸预混液、质控品试剂；所述PCR检测核苷酸预混液包括PCR检测核苷酸预混液I和PCR检测核苷酸预混液II；所述PCR检测核苷酸预混液I包括所述第一组核苷酸序列，所述PCR检测核苷酸预混液II包括所述第二组核苷酸序列。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核苷酸序列SEQIDNO.04的3’端带有间壁3修饰，或磷酸化修饰；所述核苷酸序列SEQIDNO.04的第16、23、25、32位腺嘌呤核苷酸带有锁核酸修饰。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述核苷酸序列SEQIDNO.17的3’...

【专利技术属性】
技术研发人员：林有升，张淑娟，丁崴，
申请(专利权)人：苏州艾达康医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32