检测样本中PRCC-TFE3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开用于检测样本中PRCC‑TFE3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒，其包括针对1型PRCC‑TFE3的上下游引物和探针，针对2型PRCC‑TFE3的上下游引物和探针，针对3型PRCC‑TFE3的上下游引物和探针，针对4型PRCC‑TFE3的上下游引物和探针，以及针对β‑actin内参基因的上下游引物和探针。本发明专利技术可快速检测样本中是否存在PRCC‑TFE3融合基因及其表达量的多少。利用本发明专利技术完成的检测结果准确且灵敏，可为人类Xp11.2易位/TFE3融合基因相关性肾癌患者辅助制定个体化治疗方案。

Detection of PRCC-TFE3 Fusion Gene Oligonucleotides, Methods and Kits in Samples

The invention discloses oligonucleotides, methods and kits for detecting PRCC TFE3 fusion gene in samples, including upstream and downstream primers and probes for type 1 PRCC TFE3, upstream and downstream primers and probes for type 2 PRCC TFE3, upstream and downstream primers and probes for type 3 PRCC TFE3, upstream and downstream primers and probes for type 4 PRCC TFE3, and internal reference genes. Upstream and downstream primers and probes. The invention can quickly detect whether PRCC TFE3 fusion gene exists in a sample and the amount of its expression. The detection result of the present invention is accurate and sensitive, and can assist to formulate individualized treatment scheme for human Xp11.2 translocation/TFE3 fusion gene-related renal cancer patients.

【技术实现步骤摘要】
检测样本中PRCC-TFE3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒
本专利技术属于生物科学和生物
，特别涉及一种检测样本中PRCC-TFE3融合基因的方法、寡核苷酸和试剂盒，采用荧光PCR技术，检测人类Xp11.2易位/TFE3融合基因相关性肾癌患者体内PRCC-TFE3融合基因的表达水平。
技术介绍
Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌(简称Xp11.2易位性肾癌)是2004年WHO新分类出的一种肾癌独立亚型，其特征为Xp11.2位点上TFE3基因发生断裂，并与PRCC、ASPL、PSF、CLTC、NonO等相关基因发生平衡易位形成新的融合基因。据统计，Xp11.2易位性肾癌的发病率在儿童肾癌患者中约占1/3，占45岁以下肾癌的15％，对儿童及青少年患者有极大影响。TFE3基因的断裂主要发生在启动子与主要功能域之间，发生易位的是包含了TFE3功能域的断裂点端粒侧的全部基因，而新的融合基因的启动子来源于与TFE3基因发生融合的启动子。在基因组内，与TFE3形成融合的ASPL、PRCC等均属于管家基因，由于其启动子的转录活性明显高于原TFE3基因启动子，使得融合后的TFE3基因表达量升高，因而肿瘤组织高表达TFE3蛋白，这种高表达的TFE3蛋白影响细胞对转录调节的干扰作用，促进肿瘤形成。研究发现PRCC-TFE3融合蛋白的转录活性大约是野生型TFE3蛋白的3倍，有可能改变转录因子的转录能力。此外，在与有丝分裂调控点蛋白MAD2B相互作用时，PRCC-TFE3融合蛋白可能还干扰黏合与有丝分裂调控点的功能，导致基因的异常调控，最终形成肿瘤。Xp11.2易位性肾癌具有特征性的基因改变，其诊断、治疗以及预后亦有特殊之处，而其组织形态与肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌较为相似，常规诊断极易误诊和漏诊。因此，检测PRCC-TFE3融合基因对Xp11.2易位性肾癌的分类诊断及个体化治疗均有重要意义。PRCC-TFE3融合基因检测的常用技术有荧光原位杂交技术(FISH)、实时定量PCR技术(RQ-PCR)等方法。FISH检测结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。实时荧光定量PCR中常见的方法有SYBRGreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBRGreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。在Taqman技术中，RQ-PCR采用Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。
技术实现思路
本专利技术设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，采用荧光定量PCR技术，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因β-actin和目的基因PRCC-TFE3的定量标准曲线，检测目的基因PRCC-TFE3相对于内参基因β-actin的表达水平。通过调整目的基因和内参基因的引物探针比例，以及PCR反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳，从而能够满足PRCC-TFE3融合基因的检测，用于评价治疗效果、预测预后。本专利技术中的“PRCC-TFE3cDNA序列”指的是PRCC-TFE3融合基因经转录后产生的mRNA经逆转录后产生的cDNA序列，或者根据这种cDNA序列通过化学合成手段直接合成出。将不论是经过逆转录还是通过化学合成手段直接产生的PRCC-TFE3cDNA序列插入到合适的质粒后，可作为阳性对照品进行使用。本专利技术提供用于检测样本中PRCC-TFE3融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括(1)～(4)中的至少一种：(1)针对1型PRCC-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQIDNO:1、2和4；(2)针对2型PRCC-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQIDNO:1、3和4；(3)针对3型PRCC-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQIDNO:5、6和7；(4)针对4型PRCC-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQIDNO:8、9和10。进一步地，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQIDNO:11、12和13。本专利技术还提供一种检测样本中PRCC-TFE3融合基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取样本中的RNA；(2)将(1)提取出的RNA逆转录为cDNA；(3)加入(2)中所述的cDNA到反应管中，利用针对1型PRCC-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的1型PRCC-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQIDNO:1、2和4；利用针对2型PRCC-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的2型PRCC-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQIDNO:1、3和4；利用针对3型PRCC-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的3型PRCC-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQIDNO:5、6和7；利用针对4型PRCC-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的4型PRCC-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQIDNO:8、9和10；利用针对β-actin内参基因的上下游引物和探针检测样本中的β-actin内参基因的荧光信号，其碱基序列分别为SEQIDNO:11、12和13；(4)根据(3)中的1型PRCC-TFE3、2型PRCC-TFE3、3型PRCC-TFE3或4型PRCC-TFE3的荧光信号和β-actin内参基因的荧光信号，确定样本中的1型PRCC-TFE3、2型PRCC-TFE3、3型PRCC-TFE3或4型PRCC-TFE3的相对表达量。本专利技术还提供一种检测样本中PRCC-TFE3融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，所述检测体系PCR反应液包括(1)～(4)中的至少一种：(1)针对1型PRCC-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQIDNO:1、2和4；(2)针对2型PRCC-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQIDNO:1、3和4；(3)针对3型PRCC-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQIDNO:5、6和7；(4)针对4型PRCC-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQIDNO:8、9和10。进一步地，所述引物和探针还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQIDNO:11、12和13。进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述阳性对照品为含有PRCC-TFE3cDNA序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有PRCC-TFE3cDNA序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。进一步地，所述阳性质粒包括含有1型PRCC-TFE3cDNA序列的阳性质粒、含有2型PRCC-TFE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测样本中PRCC‑TFE3融合基因的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括(1)～(4)中的至少一种：(1)针对1型PRCC‑TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和4；(2)针对2型PRCC‑TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、3和4；(3)针对3型PRCC‑TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:5、6和7；(4)针对4型PRCC‑TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:8、9和10。

【技术特征摘要】
1.用于检测样本中PRCC-TFE3融合基因的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括(1)～(4)中的至少一种：(1)针对1型PRCC-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQIDNO:1、2和4；(2)针对2型PRCC-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQIDNO:1、3和4；(3)针对3型PRCC-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQIDNO:5、6和7；(4)针对4型PRCC-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQIDNO:8、9和10。2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQIDNO:11、12和13。3.一种检测样本中PRCC-TFE3融合基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)提取样本中的RNA；(2)将(1)提取出的RNA逆转录为cDNA；(3)加入(2)中所述的cDNA到反应管中，利用针对1型PRCC-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的1型PRCC-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQIDNO:1、2和4；利用针对2型PRCC-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的2型PRCC-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQIDNO:1、3和4；利用针对3型PRCC-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的3型PRCC-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQIDNO:5、6和7；利用针对4型PRCC-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的4型PRCC-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQIDNO:8、9和10；利用针对β-actin内参基因的上下游引物和探针检测样本中的β-actin内参基因的荧光信号，其碱基序列分别为SEQIDNO:11、12和13；(4)根据(3)中的1型PRCC-TFE3、2型PRCC-TFE3、3型PRCC-TFE3或4型PRCC-TFE3的荧光信号和β-actin内参基因的荧光信...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛林梅，吴鹏飞，王淑一，
申请(专利权)人：福州艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35