一种鉴定宫颈癌遗传易感性的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种鉴定宫颈癌遗传易感性的检测试剂盒，属于分子生物学与生物医药技术领域。所述检测试剂盒中含有基于DUT基因单核苷酸多态性设计的特异性引物，DUT基因中的两个位点的单核苷酸多态性与宫颈癌易感性密切相关，即核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列的第2318位和第9533位均存在单核苷酸多态性，分别为A>G和C>T。利用PCR技术可以有效检测DUT基因中的单核苷酸多态性，进而鉴别宫颈癌易感性，这对于宫颈癌高危人群的筛选和易感个体的检测，对宫颈癌这个复杂性疾病进行早期预防、早期诊断和个性化防治具有重要的现实意义。

A test kit for identifying genetic susceptibility to cervical cancer

The invention discloses a test kit for identifying genetic susceptibility of cervical cancer, which belongs to the field of molecular biology and biomedical technology. The detection kit contains specific primers designed on the basis of single nucleotide polymorphism of DUT gene. The single nucleotide polymorphism of two sites in DUT gene is closely related to susceptibility to cervical cancer. That is to say, there are single nucleotide polymorphisms at position 2318 and 9533 of the nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO.1, respectively, A > G and C > T. The single nucleotide polymorphism in DUT gene can be effectively detected by PCR to identify the susceptibility of cervical cancer. It is of great practical significance for screening high-risk groups of cervical cancer and detection of susceptible individuals, as well as for early prevention, early diagnosis and individualized prevention of cervical cancer, a complex disease.

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定宫颈癌遗传易感性的检测试剂盒
本专利技术涉及分子生物学与生物医药
，具体涉及一种鉴定宫颈癌遗传易感性的分子标记及其应用。
技术介绍
宫颈癌发病率位居全世界妇女恶性肿瘤的第四位，在我国，宫颈癌已经成为女性最常见的癌症，死亡率高达30.5/100000，同时发病率也在不断上升。高危人乳头瘤病毒(high-riskhumanpapillomavirus，HR-HPV)感染是其发病的主要致病源。然而流行病学调查发现，实际上有约80％的妇女在其一生中都曾经感染过HPV病毒，有的甚至反复被不同类型的HPV感染，但其实只有一小部分最终进展为浸润性宫颈癌。家系研究表明，宫颈癌发病除了HPV病毒对宫颈上皮细胞的攻击外与个体的遗传背景密切相关，具有显著的遗传性，不同遗传背景的个体对HPV攻击后的致病性存在明显的不同，这种由于遗传背景不同导致的肿瘤易感性不同在宫颈癌致病过程中起着重要和关键的作用。根据临床和流行病学研究发现，宫颈癌的发病从HPV感染到恶性肿瘤的发生周期长达十年以上，这期间还有漫长的癌前病变阶段，这就为我们对其进行早期诊断、早期预防、早期治疗提供了宝贵的时间窗口，可以明显提高宫颈癌患者的治疗效果和预后，甚至可以做到防止宫颈上皮细胞在遭受HPV攻击后恶性转变，从而防止宫颈癌的发生。因此探讨宫颈癌发生发展的分子机制，探寻用于鉴定宫颈癌遗传易感人群的分子标记，对于预测宫颈癌易感人群并且早期进行医学干预和个体化治疗具有重要的现实应用价值。目前已经发现了一些宫颈癌的易感基因和遗传变异可能引起基因组的不稳定，最终导致癌基因和抑癌基因的表达和功能改变，但这只能解释一小部分宫颈癌的遗传易感性。因此，需要更为全面和精确的对基因组变异和分子标记进行研究，更好的理解宫颈癌的遗传易感性。为维护人类基因组在生育和细胞分裂过程中遗传物质的完整性和稳定性，人类基因组有一套强大的DNA修复系统，以应对环境攻击、复制错误和累积遗传学错误。主要包括了五种DNA修复途径，包括碱基切除修复(BER)、错配修复、核苷酸切除修复、直接逆转和重组修复，共有100多个基因参与其中，如果这些基因本身的表达和功能发生了改变，那么对基因组的稳定性将产生根本性的改变，导致各种疾病的发生，尤其是肿瘤的发生。dUTPase(DUT)催化脱氧尿苷三磷酸(dUTP)水解成dUMP和焦磷酸盐，从而去除并修复DNA复制过程中产生的错误碱基，使得基因组DNA保持正确和稳定。有文献报道DUT功能的改变和肿瘤的发生密切相关，但迄今为止还没有报道DUT基因单核苷酸多态性(SNP)与肿瘤的易感性相关，在宫颈癌中更是没有研究报道。因此，本领域急需进一步找寻宫颈癌易感性相关遗传学分子标记，开发检测宫颈癌高危人群和易感个体的方法、试剂盒和检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于鉴别发现宫颈癌致病易感性的分子标记，并基于此开发出用于检测宫颈癌易感性的试剂盒和检测方法，为宫颈癌易感人群的发现并为宫颈癌患者的早期诊断、预防和治疗的个体化提供检测方法。为达到上述目的，本专利技术采取如下技术方案：本专利技术针对大量候选基因的SNP位点在宫颈癌大样本量临床标本中进行了基因型检测和统计分析，首次发现了DUT基因的两个SNP位点和宫颈癌致病易感性密切相关，具体为：核苷酸序列如SEQIDNO.1(NG_029497)中DUT基因序列的第2318位(rs3784619)和第9533位(rs11637235)存在单核苷酸多态性，分别为A>G和C>T碱基间的转换，均与宫颈鳞状细胞癌的发病存在统计学相关性，而且这种相关性在其癌前病变(CINIII)中已经表现出来，基因型为2318GG纯合子和9533TT纯合子的个体罹患CINIII和宫颈鳞状细胞癌的易感性明显增加，因此DUT基因的这两个SNP位点可以作为宫颈癌致病易感性检测和早期诊断的遗传分子标记。因此，本专利技术提供了核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的遗传学分子标记作为检测靶点在制备用于鉴定宫颈癌遗传学易感性的检测试剂盒中的应用，所述遗传学分子标记的第2318位存在单核苷酸多态性：A>G，即该序列的第2318位的碱基包括碱基A和碱基G两种情况，当碱基为A时，表现为正常的DUT基因遗传状态，当碱基为G时，表现为异常或者错误的DUT基因遗传状态；或者所述遗传学分子标记的第9533位存在单核苷酸多态性：C>T，该序列的第9533位的碱基包括碱基C和碱基T两种情况，当碱基为C时，表现为正常的DUT基因遗传状态，当碱基为T时，表现为异常或者错误的DUT基因遗传状态。作为上述分子标记的应用，本专利技术提供了两种用于鉴别宫颈癌致病易感性的试剂盒，分别基于DUT基因的两个SNP位点设计对应的PCR扩增引物对。一种鉴定宫颈癌遗传学易感性的检测试剂盒，包括：用于检测核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的遗传学分子标记中第2318位的SNP位点的特异性引物。针对该SNP位点的单核苷酸多态性，本专利技术设计合成了两条特异性上游引物和一条特异性下游引物，每一条特异性上游引物分别对应相应的碱基A和碱基G，分别和下游引物配对后作特异性PCR扩增，扩增产物长度244bp，根据配对引物扩增的PCR特异性阳性条带情况判断基因型是纯合子(AA或者GG)还是杂合子(AG)。为提高PCR扩增的特异性，在设计上游引物时把上游引物的3’端倒数第二个碱基设计为与互补链相同的碱基，而不是互补的碱基，这能完全避免非特异性PCR条带的出现，保证特异性的检测结果。具体地，所述PCR扩增上下游引物序列为：上游引物1:5'-ATCTCCAGGGGCCGTTCAGA-3'(SEQIDNO.2)；上游引物2:5'-ATCTCCAGGGGCCGTTCAGG-3'(SEQIDNO.3)；下游引物1:5'-TAAGCTTTACTGTGTGCCA-3'(SEQIDNO.4)；所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶和dNTP混合液。各组分间的数量关系为常规PCR扩增时的比例，对所属专业领域内的技术人员是常规知识。为避免假阴性的出现，试剂盒中还设计并人工合成了阳性对照Ⅰ和阳性对照Ⅱ，当阳性对照无扩增产物时，说明为假阴性，实验需要重复。所述阳性对照Ⅰ序列如SEQIDNO.5所示的基因碱基片段；所述阳性对照Ⅱ含序列如SEQIDNO.6所示的基因碱基片段。PCR反应体系组成：共30μL体积，内含：50ng基因组DNA,1.0UTaqDNA聚合酶，0.2mMdNTP，上下游引物各5.0pmol。PCR产物长度为244bp。PCR扩增条件：94℃5min，(94℃30s，56.5℃30s，72℃45s)×35cycles，72℃10min，10℃保温。另一种鉴定宫颈癌遗传学易感性的检测试剂盒，包括：用于检测核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的遗传学分子标记中第9533位的SNP位点的特异性引物。针对该SNP位点的单核苷酸多态性，本专利技术设计合成了两条特异性上游引物和一条特异性下游引物，每一条特异性上游引物分别对应相应的碱基C和碱基T序列，分别和下游引物配对作特异性PCR扩增，扩增产物长度为310bp，根据配对引物扩增的PCR特异性阳性条带情况判断基因型是纯合子(CC或者TT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的遗传学分子标记作为检测靶点在制备用于鉴定宫颈癌遗传易感性的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述遗传学分子标记的第2318位存在单核苷酸多态性：A>G，即该序列的第2318位的碱基包括碱基A和碱基G两种情况；或者所述遗传学分子标记的第9533位存在单核苷酸多态性：C>T，该序列的第9533位的碱基包括碱基C和碱基T两种情况。

【技术特征摘要】
1.核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的遗传学分子标记作为检测靶点在制备用于鉴定宫颈癌遗传易感性的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述遗传学分子标记的第2318位存在单核苷酸多态性：A>G，即该序列的第2318位的碱基包括碱基A和碱基G两种情况；或者所述遗传学分子标记的第9533位存在单核苷酸多态性：C>T，该序列的第9533位的碱基包括碱基C和碱基T两种情况。2.一种鉴定宫颈癌遗传易感性的检测试剂盒，其特征在于，包括：用于检测核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的遗传学分子标记中第2318位的SNP位点的特异性引物对。3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述特异性引物对为两对，其中一个引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，另一个引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。4.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括dNTP混合液、TaqDNA聚合酶和PCR缓冲液。5.如权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶枫，陈怀增，王浛知，程琪，陈晓静，马俊彦，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33