一种检测阿尔茨海默病易感性的试剂制造技术

本发明专利技术公开了一种检测阿尔茨海默病易感性的试剂，属于医学生物技术领域。本发明专利技术通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的AR基因rs139374285 T>C位点的基因型，预测受试者对阿尔茨海默病的易感性。本发明专利技术的优点是：首次阐明了AR基因多态性位点与AD的相关性，提供了一种预测AD易感性的方法，该方法可用于AD的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。

【技术实现步骤摘要】
一种检测阿尔茨海默病易感性的试剂
本专利技术涉及一种检测阿尔茨海默病易感性的试剂，更具体的说是通过测定受试者的AR基因rs139374285T>C位点的基因型，预测受试者对阿尔茨海默病的易感性；该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于生物

技术介绍
阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)是1906年德国医生阿尔茨海默首次提出的表现为认知和记忆功能不断恶化的慢性神经退行性疾病，是老年人常见的神经系统变性病。据估计，2011年全球痴呆患病率高达2400万，预计到2040年，每20年加倍，而且随着人口老龄化的进展，其发病率呈上升趋势。据2011年世界卫生组织估计，全球AD患者的相关费用占60岁以上人口疾病总支出的11.2％。2005年的统计资料显示我国60岁以上人口有1.2亿，痴呆患病率为3-8％，其中60％以上为AD，随着人口老龄化的进一步加剧，50年后AD人数将达到2000万。我国是人口大国，目前尚无AD的卫生经济学统计数字，由AD所造成的经济损失不可低估。流行病学调查显示阿尔茨海默病具有较高的致残率和死亡率，主要原因在于阿尔茨海默病属于不可逆性疾病，患者就诊时，往往属于病程“中晚期”，已失去最佳治疗时机，此时对患者实施干预措施收效甚微。并且阿尔茨海默病病理性质比较复杂，目前尚缺乏特异、可靠、高效的实验诊断方法，能够在患者出现痴呆症状前做出准确的判断并进行治疗。随着分子生物学技术的进步和AD遗传学研究上的新发现，遗传因素在AD发生、发展中的作用逐步受到重视。在阿尔茨海默病的诊断标准进行修订时，将遗传学证据和生物标志物纳入AD的诊断标准。目前进行AD遗传病因研究，多采用SNP作为基因组标志的关联分析方法，是有效的，已得到证明。SNP是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需>1％，SNPs是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70.1％为同型碱基之间的转换：如G/A或T/C，29.1％为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。C(胞嘧啶)是人类基因组中最易发生变化的位点，因为大多数是甲基化胞嘧啶，能够自发脱氨基转换为T(胸腺嘧啶)，SNP包含了已知多态性的80-90％，是最常见的遗传变异。由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个(BrookesAJ,TheessenceofSNPs.Gene,1999；234:177-186.)。SNP以其密度高(平均每1kb就有1个)、代表性强(位于基因内部的SNP可能直接影响蛋白质结构或表达水平)、遗传稳定性好(同微卫星多态性比较而言)、易于自动化分析(因SNP在人群中多为双等位基因标记，可简单以“+/－或1/0”直接分型)等特点成为很好的遗传标志。目前已明确四种基因的突变或多态性与AD有关。这些AD相关基因包括：第21号染色体上的淀粉样前体蛋白(APP)基因，第14号染色体上的早老素(PS1)基因，第1号染色体上的早老素(PS2)基因和第19号染色体上的载脂蛋白E(ApoE)基因。AR(AndrogenReceptor，雄激素受体)基因被定位于X染色体(Xq11.2-12)，包含8个外显子和7个内含子，全长约90kb，编码918个氨基酸。该基因由4个结构域组成：低保守的氨基端结构域，高保守的DNA结合结构域，铰链区以及高保守的羧基端配体结合结构域。该基因的突变与完整的雄激素不敏感性有关，介导核受体和转录雄激素受体核信号。目前尚无任何关于AR基因与AD相关联的研究结果。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种预测阿尔茨海默病易感性的方法。本专利技术的第二个目的是提供一种预测阿尔茨海默病易感性的试剂，包括PCR引物和含有该引物的试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种分离核酸序列，具有序列表SEQIDNo.1所示的碱基序列，其rs139374285T>C即是变异位点，以字母”Y”标示出。该核酸序列为AR基因第4内含子序列的一部分。图1为AR基因结构及其多态性变异位点的示意图，附图中包含有7个内含子，rs139374285T>C位点标在AR基因图中第4内含子区的相应位置。一种预测阿尔茨海默病易感性的方法，通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的AR基因rs139374285T>C多态性位点的基因型，预测受试者对阿尔茨海默病的易感性：AR基因rs139374285T>C的基因型为TT时，受试者的易感性最低；携带C等位基因时，受试者的易感性升高。一组检测阿尔茨海默病易感性的引物，引物的核苷酸序列分别为序列表SEQIDNo.2和序列表SEQIDNo.3所示，长度分别为24bp和18bp，而且可以特异性地扩增出包含有SEQIDNo.1所示序列中rs139374285T>C位置的产物。本专利技术提供了一种检测阿尔茨海默病易感性的诊断试剂盒，其中含有本专利技术特异性扩增AR基因rs139374285T>C位点的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。本专利技术试剂盒中的全部组分、含量、来源和使用方法如下：一种检测阿尔茨海默病易感基因的试剂盒，由以下试剂组成：(1)10μL10×PCR缓冲液；(2)2μL10mMdNTP混合液；(3)2μLTaqDNA聚合酶，2unit/μL；(4)1μLF1引物，为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/μL；(5)1μLR1引物，为SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/μL；(6)8μL10×LC-GreenPlus饱和荧光染料；(7)2μL寡核苷酸内参，由4种内参引物各0.5μL组成，浓度为10pmol/μL，其中低温寡核苷酸内参上游引物F为SEQIDNO.4所示的核苷酸序列，低温寡核苷酸内参下游引物R为SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参上游引物F为SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参下游引物R为SEQIDNO.7所示的核苷酸序列；(8)64μL纯水。使用方法：(1)PCR扩增：通过PCR扩增AR基因的第4内含子区部分片段，制备混合液：10×PCR反应缓冲液1μL，10mM/LdNTP0.2μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，10pM/L上游引物0.1μL，10pM/L下游引物0.1μL，10×LC-GreenPlus饱和荧光染料0.8μL，寡核苷酸内参0.2μL(高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0.05μL)(序列见表1)，基因组DNA1μL，加纯水至10μL。PCR反应条件为95℃预变性3min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸4s，总共45个循环，72℃总延伸2min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理：95℃30s，25℃2min，94℃30s，24℃4min。PCR前于每一体系中加入20μL的石蜡油，以防止液体挥发。(2)基因型判定：将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在LightScannerTMHR-I96上进行HRM分析，用LightScannerCallIT软件对采集本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测阿尔茨海默病易感性的方法，其特征在于：通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的AR基因rs139374285T>C多态性位点的基因型，预测受试者对阿尔茨海默病的易感性。

【技术特征摘要】
1.检测AR基因rs139374285T>C多态性位点基因型的引物用于制备预测阿尔茨海默病易感性的试剂盒的用途，所述引物的核苷酸序列分别为序列表SEQIDNo.2和序列表SEQIDNo.3所示。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述预测阿尔茨海默病易感性的试剂盒由以下试剂组成：（1）10µL10×PCR缓冲液；（2）2µL10mMdNTP混合液；（3）2µLTaqDNA聚合酶，2unit/µL；（4）1µLF1引物，为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/µL；（5...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱小泉，王娜娜，惠娟，赵承孝，刘铭，王建业，史晓红，魏东，杨帆，张耀光，梁思颖，唐雷，孙亮，杨泽，
申请(专利权)人：卫生部北京医院，
类型：发明
国别省市：北京;11