一种质粒标准品及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种类风湿关节炎检测用的质粒标准品，及其制备方法和用途。其可以用于药物基因检测室间质评体系使用，并以此为基础建立临床治疗药物基因检测室间质评体系，这对开展药物基因检测室间质评具有重大意义，并对提升药物基因检测实验室的竞争力有重大的现实意义。本发明专利技术的质粒标准品特异性高，重现性稳定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及个体化医学基因分型实验质量控制领域，尤其涉及一种预测甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎疗效的基因分型质控品。
技术介绍
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种临床常见的自身免疫性疾病，其主要表现为慢性、对称性、破坏性多关节炎，其中双手、腕、膝、踝、和足关节受累最为常见。若不尽早给予合理治疗，病情会逐渐发展，最终可致关节畸形和功能丧失，严重影响患者生活质量。目前，甲氨蝶呤(methotrexate)是国内外治疗RA的首选药物之一，因其物美价廉而成为RA患者使用最广泛的基础用药。甲氨蝶呤主要通过抑制叶酸代谢，从而抑制细胞增殖和复制，其可作用于氨基咪唑甲酰胺酶(ATIC)，减少5-氨基咪唑-4-氨甲酰胺核苷酸(AICAR)转化为5-甲酰氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(FAICAR)，导致AICAR在细胞内蓄积。而AICAR同时又可通过抑制腺苷脱氨酶(ADA)和腺苷单磷酸脱氨酶(AMPD)活性，减少腺苷和腺苷酸分解，从而增加这两种物质在细胞内的浓度。腺苷作为抑制抗炎性介质，通过与相应的腺苷受体的结合，调节甲氨蝶呤的抗炎作用。近年来，药物基因组学(pharmacogenetics)的，近年来药物基因组学(pharmacogenetics)研究揭示，编码药物代谢酶、药物转运体和药物作用靶点的基因序列的不同是引起药物个体化差异的一个主要原因，20％-95％药物反应和处置的个体差异却是由遗传因素引起的。药物基因组学研究则为实现个体化临床用药提供了新的途径。氨基咪唑甲酰胺酶(ATIC)基因位于2q35，存在数种多态性标记，其中包含rs4673993(C>T)位点。Lee YC等人对120名接受甲氨蝶呤单药治疗的类风湿关节炎患者开展的研究发现，ATIC rs4673993位点突变与低疾病活性相关(P＝0.01)。与基因型为TT的类风湿性关节炎患者相比，基因型为CC的患者接受甲氨蝶呤治疗可获得较好的疗效。基因型为CT的患者则获得中等疗效。因此，类风湿关节炎患者的rs4673993(C>T)基因分型决定其甲氨蝶呤治疗的疗效。
因此，对接受甲氨蝶呤治疗的类风湿关节炎患者进行ATIC rs4673993(C>T)基因分型检测能够预测其治疗疗效，从而为个体化治疗提供依据。国外开展临床实验室室间质量评价已有60年历史。近十年来，我国临床实验室也已经普遍开展了室间质评活动，用于评价实验室检测的准确性和各实验室间结果的一致性。然而，目前已开展的室间质评项目内容主要限于临床检验，与个体化用药监测相关的仅有治疗药物监测(TDM)，且种类和方法有限。随着个体化用药新技术的发展、国家对新药研发的鼓励和投入增多，越来越多的医院、临床实验室陆续开展药物基因检测、药物血中浓度检测项目。由于国家相关政策尚未完善、对机构的监督及核查不足，各个检测机构水平参差不齐，造成了不同实验室监测水平差异显著，严重影响了数据的准确性，数据质量的不可靠可能为药物个体化应用埋下潜在风险。如果有标准的室间质量评价体系，就可以确定某个实验室进行检测或测量的能力，并监控实验室的持续发展能力；识别实验室中的问题并制定相应的补救措施；确定新的检测和测量方法的有效性和可比性，并对这些方法进行相应的监控；增加实验室用户的信心；识别实验室间的差异，从而可保证个体化用药的有效性和安全性。全国开展药物基因检测的各家单位在标本采集和保存、DNA提取方法、基因型检测方法、检测结果的分析和解释等方面存在很大差异，而这些差异将直接影响检测结果的准确性，从而影响个体化用药方案制定的可靠性。其中，基因检测方法是影响最终检测结果的关键因素。目前应用的基因检测的方法主要有PCR扩增后限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析方法、Taqman探针法、DNA测序法、基因分型芯片法以及微测序法等。其中，DNA测序法是目前进行基因检测的金标准，PCR-RFLP法应用较为广泛，但都容易发生样品间交叉污染。另外，探针法操作过程虽然简单，但探针在反复冻融后容易失效。可见，各种基因检测方法各有优劣，其结果难以保证一致。所以，各实验室检测的结果有待一个第三方室间质评标准进行评估。在卫生部临床检验中心印发的《医疗机构临床药学实验室管理暂行办法》中，将药物基因检测纳入医疗机构临床药学实验室管理，并指出开展检测的实验室每
年必须参加实验室之间的质量评价活动。全国开展药物基因检测的各家单位在标本采集和保存、DNA提取方法、基因型检测方法、检测结果的分析和解释等方面存在很大差异，而这些差异将直接影响检测结果的准确性，从而影响个体化用药方案制定的可靠性。但是，目前国内尚缺乏一个药物基因检测室间质评体系。而基因检测阳性质控品则是药物基因检测室间质评体系一个重要组成部分。因此，本专利技术提供一种基因检测质控品以供药物基因检测室间质评体系使用，这对开展药物基因检测室间质评具有重大意义，并对提升药物基因检测实验室的竞争力有重大的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的用于甲氨蝶呤个体化用药检测实验质量控制的标准品解决了现有技术中存在的问题，提供一种基因检测质控品以供药物基因检测室间质评体系使用，这对开展药物基因检测室间质评具有重大意义，并对提升药物基因检测实验室的竞争力有重大的现实意义。本专利技术的目的在于提供一种预测甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎疗效的基因分型质控品，为甲氨蝶呤治疗类风湿性关节炎的疗效预测提供参考依据。为实现上述目的，本专利技术可采取下述技术方案：本专利技术所述的质控品核苷酸序列为SEQ ID NO.1：TACACGCTGGGTACTGTCAGGCTTCAGTGGCTCTGTGGTTTTGGAGGGCAGAGAGGAGATTTCCCTCACACTGCTCCCACAACCATATTTTTAGTGTATAATTATCTGGCTAAATAGATTTCTGTTTAATTTAGCACAGGCACTAGAAAACGTGCTGCGTAGACTGGGTGTTAAGAAAACTGTCTTGATTTAGGAGTTGACAGGTAGTAACTTTAGCTTTCTTTGTTTATGATTTTACTATTTTCTAACCAGGTGCTGCTGTTGGAATTCCACTCAGTGAAGATGAGGCCAAAGTCTGCA所述质控品模板是含有插入ATIC特异性核苷酸序列的PES质粒载体，该载体可在大肠杆菌中扩增，并采用标准的质粒提取办法进行制备。本专利技术的有益效果提供一种基因检测质控品以供药物基因检测室间质评体系使用，这对开展药物基因检测室间质评具有重大意义，并对提升药物基因检测实验室的竞争力有重大的现实意义。附图说明图1是本专利技术阳性质控品模板的核苷酸序列和质粒载体图。图2是本专利技术阳性质控品模板的核苷酸序列的测序结果。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1质粒标准品的制备方法1、通过PCR方法获得目的基因根据基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种类风湿关节炎检测用的质粒标准品，其特征在于是含有SEQ ID NO.1所示序列，该序列含有ATIC rs4673993 位点突变，该点突变为C。

【技术特征摘要】
2015.05.20 CN 20151025976511.一种类风湿关节炎检测用的质粒标准品，其特征在于是含有SEQ ID NO.1所示序列，该序列含有ATIC rs4673993 位点突变，该点突变为C。2.如权利要求1所述的质粒标准品，其特征在于所述的SEQ ID NO.1片段构建于载体上，所述的载体是pES载体。3.权利要求1所述的质粒标准品在制备药物基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨莉萍，
申请(专利权)人：卫生部北京医院，
类型：发明
国别省市：北京;11