一种质粒DNA定量检测试剂盒制造技术

本发明专利技术首次提供了一种质粒DNA定量检测试剂盒，具有采用高准确度的超声波-同位素稀释质谱法准确定量的质粒DNA标准品，弥补了现有试剂盒不能对质粒DNA进行定量的缺点。本发明专利技术还提供了一种质粒DNA定量检测方法，分别测定不同浓度的质粒DNA标准品的荧光信号强度，绘制浓度—荧光信号强度标准曲线；然后测定待测质粒DNA样品荧光信号强度，根据所绘制标准曲线可准确计算出待测样品的DNA浓度。本方法和试剂盒首次采用标准质粒作为荧光染料法中的DNA标准进行定量，灵敏度高，可检测低至1pg的DNA；线性范围广，可检测0.25ng/mL~1000ng/mL的质粒DNA；对标准质粒采用超声波-同位素稀释质谱方法定量，得到的量值不确定度低，准确度高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生化分析领域，具体涉及一种质粒DNA荧光染料定量检测方法和检测试剂盒。
技术介绍
质粒DNA是游离于染色体外的小型(l_200kb)的共价、闭合、环状的双链DNA分子，能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。它通常编码一些酶基因，如产生抗生素、抗生素抗性、限制酶、修饰酶等有利于宿主的酶基因。由于它分子小、能够自主复制并且稳定遗传，因此是分子生物学、基因工程技术中常用的载体。在分子生物学领域进行DNA分析时常常需要对质粒DNA进行准确定量，如进行克隆文库构建时的酶切和连接操作，以及对质粒DNA进行测序时，为了得到良好的后续实验结果，都需要对质粒DNA的浓度进行准确测定。因此对质粒DNA定量有着广泛的应用。 采用Pic0Green荧光染料法对核酸进行定量，因其方法的灵敏度高、线性范围广，因此应用非常广。然而，PicoGreen荧光染料法在对DNA进行定量时的局限性表现为，第一，方法的准确度高低取决于试剂盒中DNA标准品含量的准确度，而目前市售的试剂盒中DNA标准品的含量值均为厂家提供的一个参考值，S卩？ ng/ml，这个值一般是通过紫外吸收(0D260)确定的，该值也没有相关的不确定度信息和溯源性。第二，由于PicoGreen对不同分子大小的DNA结合效率会有差异，如果依据定量的DNA标准和所测定的DNA样本分子大小差异很大时，会导致对样本定量结果的偏差很大，而目前商业化的试剂盒中均只有一个分子大小的DNA标准，即Lambda噬菌体DNA标准(48. 5K)。有报道称以Lambda为标准，如果对分子量<23kb的DNA进行定量，测定结果会比真实结果偏低。因此，如果对质粒DNA采用PicoGreen法定量，由于质粒DNA标准品的缺乏,现有的商业化的试剂盒还无法满足要求。因为PicoGreen荧光染料法对质粒DNA定量需要具有准确量值的质粒DNA标准物质，而目前并没有含有准确量值的质粒DNA标准可用作PicoGreen法定量质粒的标准。由于该量值直接关系到试剂盒定量方法的准确度高低，因此要研制质粒DNA标准品，必须选择准确度高，溯源途径清晰的DNA绝对定量方法。对质粒DNA进行绝对定量的方法有基于单分子扩增的数字PCR方法、有依赖于磷元素标准的电感耦合等立体发射光谱法。我们建立了一种基于核苷酸标准品的超声波-同位素质谱法，可对质粒DNA进行绝对定量，从而为PicoGreen荧光染料法提供DNA标准。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种质粒DNA荧光染料定量检测方法和检测试剂盒，该方法灵敏度高，线性范围广，准确度高，精密度好。本专利技术首次建立了质粒DNA荧光染料法定量检测方法，采用质粒DNA标准，利用PicoGreen法对质粒DNA进行准确定量,本专利技术人进行了如下研究工作I、质粒DNA浓度与荧光信号强度是否存在线性关系(见实施例I)将构建的5k大小的质粒稀释成不同浓度的DNA样品，稀释后的质粒DNA与PicoGreen突光染料结合后,测定突光信号。结果发现质粒DNA浓度与荧光信号成正比，线性相关系数为O. 99。因此可以以荧光信号强度测算质粒DNA浓度。本研究为确定本方法的可行性打下了基础。2、不同分子量大小的DNA与荧光信号强度的线性关系差别(见实施例3)选择了分子大小分别为5k，9k，48k的质粒/基因组分子作为研究对象，分别将DNA进行梯度稀释，稀释后的DNA与PicoGreen荧光染料结合后，测定荧光信号。 结果发现4种不同分子量的DNA，浓度与荧光信号均成正比，且线性相关性都很好，相关系数均>0. 99。但不同分子量大小的DNA与荧光信号的线性关系(斜率)不同，分子量越大，直线的斜率越大。以商业化试剂盒lambda DNA作为标准(48k)测定2k IOk的质粒DNA,结果偏差较大，具体见表2。此研究结果表明，测定质粒DNA浓度应选择分子量差别不大的质粒DNA标准品。3、研究了对质粒DNA定量的线性范围(见实施例2)将质粒DNA稀释至O. Olng/mL^lOOOOng/mL,与荧光染料结合后，测定荧光信号值，结果发现DNA浓度在O. 25ng/mL 1000ng/mL之间时，荧光强度与DNA浓度成正比。此研究确定了荧光染料法定量检测DNA的浓度范围是O. 25ng/mL 1000ng/mL。3、研究了对质粒DNA的检测灵敏度(见实施例2)由于最低检测到的荧光信号对应的DNA浓度为O. 01ng/mL，加样量100 μ L，因此计算出该方法的灵敏度为lpg。4、定量限(见实施例2)根据最低定量的线性范围，定量限为25pg。根据上述实验结果，本专利技术提供了一种质粒DNA荧光染料法定量检测方法，其特征为用不同浓度的质粒DNA标准品与Pi coGreen荧光染料混合，分别测定荧光信号强度，绘制浓度一荧光信号强度标准曲线；然后将待测质粒DNA样品稀释至0. 25ng/mL^lOOOng/mL,与荧光染料混合后，测定荧光信号强度；根据所绘制标准曲线计算待测质粒DNA样品的DNA浓度。待测质粒DNA的分子大小为2k 10k。具体操作步骤如下I)配制合适浓度的荧光染料用工作液稀释PicoGreen荧光染料至O. 6^1. O μ M浓度；2)制备不同浓度的标准品检测液用工作液对标准品进行梯度稀释，得到4 8个浓度的稀释液；如浓度为Ing/ μ L、0. 5ng/ μ L、0. 25ng/ μ L、0. lng/ μ L、0. Olng/ μ L ；取每一种浓度的标准品稀释液100 μ L分别与100 μ L步骤I)得到的荧光染料混匀；3)制备待测物检测稀释液A将待测质粒DNA样品用紫外法测定大致浓度范围后，用工作液稀释至浓度为O.25ng/mL^1000ng/mL ；B取稀释好的样品100 μ L与100 μ L步骤I)得到的荧光染料混匀；4)测定不同浓度标准品的荧光信号，绘制浓度一荧光信号强度曲线A将上述不同浓度的标准品检测稀释液转移至同一个96孔酶标板上，利用酶标仪分别读取每种浓度标准品的荧光信号强度；设置酶标仪激发波长480nm，吸收波长为520nm ；B以标准品每种DNA浓度为横坐标，以相应的突光信号值为纵坐标绘制“突光信号值-DNA浓度”标准曲线；5)测定待测物荧光信号方法同步骤4) A ;6)计算待测样品浓度将待测样品荧光信号值代入步骤4) B得到的标准曲线，得出待测样品的浓度。以上方法中，所述工作液的成分是IOmM Tris-HCl，含ImM EDTA, pH=8. O。本专利技术用超声波一同位素稀释质谱方法验证了本方法的准确度(见实施例3)。本方法的创新点是I、首次采用标准质粒作为荧光染料法中的DNA标准对质粒样品进行定量；2、灵敏度高可检测低至Ipg的DNA ；3、方法线性范围广可检测O. 25ng/mL 1000ng/mL的DNA，跨越4个数量级；4、准确度高首次采用高准确度的超声波-同位素稀释质谱法对标准质粒进行定量，得到的量值不确定度低，准确度高。本专利技术还提供了一种质粒DNA荧光染料定量检测试剂盒，试剂盒中包括质粒DNA标准品，PicoGreen荧光染料和工作液，其特征为工作液成分为IOmM Tris-HCl，含 ImM EDTA, ρΗ=8· O ；质粒DNA标准品为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种质粒DNA定量检测试剂盒，试剂盒中具有标准品、工作液和染料，其特征为：1）所述标准品为具有准确DNA浓度定量值的环状质粒分子DNA，浓度范围是1ng/μL～300ng/μL；2）所述工作液成分为10mM?Tris?HCl，含1mM?EDTA，pH=8.0；3）所述染料是PicoGreen荧光染料。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：董莲华，孟盈，王晶，傅博强，高运华，张玲，
申请(专利权)人：中国计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：