一种长链非编码RNA及其应用制造技术

本申请通过临床样本筛选获得一条可以作为结直肠癌诊断的标志物，其为一种长链非编码RNA，即IncRNA，所述的IncRNA的序列如SEQ ID NO：1所示，在设计其抑制性的RNAi片段SEQ ID NO：4并转染细胞显示，降低该IncRNA表达，明显抑制肿瘤细胞的增殖、迁徙以及提高肿瘤细胞的凋亡率，是一种潜在的治疗剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及消化道肿瘤的结直肠癌组织及细胞中的长链非编码RNA的表达及其用于制备治疗所述癌症的应用。
技术介绍
结直肠癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一。诸多类型肿瘤中，结直肠癌的分子机理研究开展比较早，研究得相对比较清楚。自Vogelstein提出经典的结直肠癌的多步骤、多基因的发生发展模式以来，结直肠癌的分子病理学在不断发展，一系列与结直肠癌发生发展有关的基因被相继发现。近二十年来，随着我国居民生活方式和饮食结构的改变，结直肠癌的发病率和死亡率呈现上升的趋势，积极开展对结直肠癌相关分子的寻找，并进行功能研究，明确其在结直肠癌发生发展中的确切作用及其相关分子机制，对寻找结直肠癌的诊断、治疗、预后靶标有很重要的意义。结直肠癌的发生发展是个多步骤的过程，其中从正常粘膜-腺瘤-癌变途径是最重要的发生模式，其中致癌基因和抑癌基因是目前研究的重点，平时两者处于平衡状态，但一旦基因突变导致这种平衡被打破就会进而促进肿瘤的形成。由于我们对多基因参与的肿瘤多步骤调控的过程认识有限，并且缺少有效的控制手段，因此探索肿瘤诊断与治疗新的分子来源就显得十分迫切。人类基因组计划及其后续的DNA元件计划的研究结果表明，编码蛋白的基因序列仅占人类基因组序列的1-3％，而人基因组中绝大部分可转录的序列为非编码的RNA，包括小片段的如microRNA以及长链的非编码RNA(long non-coding RNA，IncRNA)。近年来的许多研究都表明示IncRNA参与了一系列重要的细胞调节过程。例如长链非编码RNA参与了调节目标基因的转录、遗传印记及细胞核内的运输等众多关键的调节控制的过程，和其它包括脱氧核糖核酸甲基化、遗传印记及染色质的重新构建等表观遗传形式一样，与疾病的关系持续成为关注的热点。LncRNA是一类转录本长度超过200个核昔酸的非编码RNA，，Tsai于2011年发现长链非编码RNA有助于肿痛的早期诊断，预后的判断和可以作为分子鞭向治疗的目标基因，因此具有较好的临床应用价值。并且大量的报道证实长链非编码RNA与多种肿瘤的形成及发展有密切的关系，如肺癌、肝癌和乳腺癌等。中国科学院根据长链非编码RNA不同的特征对其进行了分类，例如根据基因组的定位和背景可分为基因内、基因间、正义以及反义；根据发挥功能的机制分为转录水平、转录后水平和翻译水平等；根据寻鞭机制又可分为信号原型、诱巧原型、指导原型、分子支架原型；根据对DNA序列的作用方式分为顺式作用和反式作用两种等。LncRNA主要通过表观遗传水平、遗传印记、转录激活、转录后调控及蛋白功能调节等不同的信号转导途径实现基因水平的调节控制。目前在非编码RNA研究中，miRNA已经取得重要的成果；因此长链非编码RNA可能也代表着另外一个重要的分子来源。目前并没有发现结直肠癌中相关的IncRNA及其作用的发现，本申请首先证实了结直肠癌中可以作为诊断标志物以及治疗靶点的IncRNA。
技术实现思路
TUC338是由多聚胞喀B定结合蛋白2(poly(rC)bindingprotein2，PCBP：2)基因独立转录形成的转录片段，TUC338就是克隆该转录片段而来的。TUC338对肿瘤的增殖活性及细胞凋亡发挥着十分重要调控作用。本专利技术提供一种在结直肠癌中高表达的可以作为诊断结直肠癌的标志物的TUC338，其具有如1)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；2)包含一个或多个取代的与SEQ ID NO：1具有90％以上的同源性的核苷酸序列。本专利技术提供一种干扰RNA序列，其可以降低细胞中TUC338的表达量，所示的细胞为结直肠癌细胞。所述的干扰RNA序列如SEQ ID NO：2所示。本专利技术提供一种干扰载体，所述的载体包含SEQ ID NO：2所示的干扰序列。本专利技术提供一种检测TUC338表达的试剂，所述的试剂为引物，所述的引物对具有如SEQ ID NO：3-4所示的序列。本专利技术提供一种诊断试剂盒，所述的试剂盒包含SEQ ID NO：2-3所述的引物对。本专利技术还请求保护TUC338作为诊断结直肠癌诊断标志物的应用，所述的TUC338具有SEQ ID NO：1所示的序列。本专利技术还请求保护一种抑制TUC338表达的试剂用于制备治疗结直肠癌药物的应用；所述的试剂为干扰RNA，优选的，所述的干扰RNA具有SEQ ID NO：4所示的序列。说明书附图图1结直肠癌肿瘤组织与癌旁组织中TUC388表达差异对比；图2 RT-PCR检测干扰RNA片段对于细胞系TUC338表达差异的对比；图3 MTT实验检测转染shRNA干扰TUC338后的细胞增殖率被抑制的情况；图4侵袭实验结果证明，在转染shRNA后，明显抑制了细胞的侵袭活性；图5转染shRNA后HT29的凋亡率显示。具体实施方式实施例1结直肠癌组织样本中TUC338表达量的检测1)、选取科病理确诊为结肠癌或直肠癌患者并且采用手术，治疗的17例结直肠癌患者的新鲜癌组织及其对应的癌旁组织(切缘3cm以外)，所有患者术前均未行化疗、放疗等抗肿瘤治疗，排除其他系统性疾病，排除转移癌可能，各个重要器官功能在正常范围么内。2)、引物的合成：在GenBank Blast查询，查找到目的基因TUC338mRNA的序列(SEQ ID NO：1)，应用Primer的express 2.0软件在CDS区上设计特异性引物探针，引物探针合成由(公司)合成，引物序列如下：Forward(5′-3)：GCCCCACCCCTTCATTCTTA(SEQ ID NO：2)Reverse(5′-3′)：CAGACACAATTTGAAACGAGCTG(SEQ ID NO：3)；β-Actin序列：Forward(5′-3)：ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGAT(SEQ ID NO：5)Reverse(5′-3′)：CTTGCACATGCCGGAGCCGTT(SEQID NO：6)；3)、总RNA的提取a)将保存在-80℃冰箱中的结直肠癌及其对应的癌旁组织取出，然后马上研磨成撤末。按100-200∶1的比例加入BiooPure，常温放置五分钟。按照BiooPure体积的五分之一加入氯仿，离心，吸取上清。b)将上一步液体，再次离也沉淀RNA后去除上清。c)用泛醇清洗RNA，常媪下干燥10分钟，跟着取少许进行检测。4)、总RNA定量和纯度检测：超微量分光光度计(QuawellQ5000)a)先用DEPC水调零；b)取1.0μl样品检测，每检测完一个样品后，纱布擦干，紧跟着再检测下一个样品；c)根据检测结果取恰量RNA定量至1.0μg，备以后研究所用。5)逆转录a)体系配制(TaKaRa D6110A)b)在PCR仪器上进行变性、退火反应：65℃5min冰上冷却；c)配制逆转录反应液体系(20μl)：d)在PCR仪上进行如下的反应：30℃10min42℃60min95℃5min；处理后，冰上放置。6)QPCR检测反应(TaKaRa DRR820A)a)体系配制混合均匀，离心，分装96孔板，各个样品各个基因进行三个重复。b)QPCR反应条件设置比较CT法分析数据，结果见图1所示。经过数据计算及统计，结直肠癌肿瘤组织中TUC388的表达升高4.31±2.13倍，且数本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种作为肿瘤诊断标志物的非编码长RNA序列，其序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种作为肿瘤诊断标志物的非编码长RNA序列，其序列如SEQ ID NO：1所示。2.如权利要求1所述的非编码长RNA序列，其中所述的肿瘤为结直肠癌。3.权利要求1-2任一项所述的长链非编码RNA序列在制备检测结直肠癌试剂盒中的应用。4.一种用于诊断结直肠癌的试剂盒，其中所述的试剂盒包括可以特异性扩增权利要求1所述的长链非编码RNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：金文君，
申请(专利权)人：湖州市中心医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33