长链非编码RNA lnc‑DIF的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种长链非编码RNA lnc‑DIF的应用，技术方案是首先检测老龄骨质疏松小鼠模型股骨样本和后肢去负荷骨质疏松小鼠模型股骨样本，发现长链非编码RNA lnc‑DIF在老龄和后肢去负荷骨质疏松小鼠的骨组织中高表达。进而设计制备长链非编码RNA lnc‑DIF的RNA干扰序列，进行成骨分化功能实验发现：长链非编码RNA lnc‑DIF抑制成骨细胞分化，并且lnc‑DIF能够特异性结合成骨相关miR‑489‑3p。这表明长链非编码RNA lnc‑DIF能够用于制备治疗各种因素引起的骨质疏松以及骨骼系统其他疾病的药物。

Application of long chain non RNA LNC DIF encoding

The invention discloses an application of long chain non encoding RNA LNC DIF, technical scheme is first to detect aging mice model of osteoporotic femur samples and hindlimb unloading femoral osteoporosis mouse model of bone tissue samples, we found that high expression of long chain RNA LNC DIF encoding non osteoporosis in aged mice to load and hind in. Then the design of RNA interference sequence by long chain encoding RNA LNC DIF non, for osteogenic differentiation function experiment shows that the long chain of non RNA LNC DIF encoding inhibited osteoblast differentiation, and the LNC DIF could specifically bind to bone related miR 489 3p. This shows that the long chain of non RNA LNC DIF encoding can be used for preparing drugs for treating various factors causing osteoporosis and other diseases of the musculoskeletal system.

【技术实现步骤摘要】
长链非编码RNAlnc-DIF的应用
本专利技术属于分子生物医学领域，特别涉及一种长链非编码RNAlnc-DIF的应用。
技术介绍
非编码RNA(Non-codingRNA)是指不编码蛋白质的RNA。其中包括microRNA(miRNA)和长链非编码RNA(longnon-codingRNA,简称lncRNA)等。这些RNA的共同特点是都能从基因组上转录，但是不编码蛋白，在RNA水平上行使各自的生物学功能。其中lncRNA是一种长大于200nt的真核内源型RNA，广泛分布于真核生物体内，在细胞分化、器官发育和疾病发生等多种生理和病理过程中起重要的调控作用。而成骨细胞是骨形成的主要功能细胞。随着人年龄的增长，骨的发育也发生着动态的变化，其中由成骨细胞引导的骨形成和由破骨细胞引导的骨吸收构成了骨重建的动态平衡。当成骨细胞分化异常时，会导致相应骨代谢疾病的发生，如骨质增生、骨质疏松、股骨头坏死、关节退行性变、脊柱侧弯等。1ncRNA可在细胞分化，个体发育和疾病中发挥重要作用，如lnc-DC可以调控神经树突状细胞分化，lncRNA-DIGIT可以调控胚胎内胚层形成，lncRNA-CLMAT1可以诱导结直肠癌肝转移等；这些研究主要集中于神经、发育、肿瘤等领域，有关lncRNA参与骨质疏松症等骨代谢疾病的研究报道较少。纽约大学西奈山医学院的DFLee等人在李-佛美尼综合症(LFS)患者iPSC来源的成骨细胞中，发现lncRNAH19的表达降低，经进一步分析发现，在恢复成骨细胞中H19的表达后，能促进成骨细胞的分化，同时抑制骨肉瘤的成瘤能力。提示了lncRNA可以对成骨细胞分化发挥作用，也说明可以利用lncRNA来作为治疗骨质疏松等骨骼系统疾病的药物。但该研究仅局限于李-佛美尼综合症患者iPSC来源的成骨细胞中，未做对于正常非病理现象(如衰老，长期卧床等)情况下的成骨细胞研究(LeeDF,etal.Modelingfamilialcancerwithinducedpluripotentstemcells,Cell.2015Apr9；161(2):240-254)。lnc-DIF作为一种lncRNA，位于小鼠19号染色体chr19:38207571-38208896，GenebankIDAK138929.1，长1326bp，最早发现于1999年(Carninci,P.&Hayashizaki,Y.High-efficiencyfull-lengthcDNAcloning,JOURNALMeth.Enzymol.1999(303),19-44)，对于其在成骨细胞分化和骨形成过程中的作用，以及其在人骨质疏松症等骨骼系统疾病的诊断和治疗中的作用能尚未见研究和报道。miR-489-3p作为一种microRNA(一类长约22～25个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子，可通过碱基互补配对的方式结合靶基因的3’非编码区，从而抑制翻译或降解靶基因)，在调控细胞增殖、分化中起重要作用。本专利技术利用生物信息学软件分析及qPCR实验发现并验证了lnc-DIF可以特异性结合miR-489-3p，并通过体内动物水平实验、体外细胞水平实验，发现lnc-DIF特异性结合miR-489-3p在制备人骨质疏松症的诊断和治疗药物中的应用。
技术实现思路
本专利技术提供一种长链非编码RNAlnc-DIF的应用。该应用首先检测老龄骨质疏松小鼠模型股骨样本和后肢去负荷骨质疏松小鼠模型股骨样本，发现长链非编码RNAlnc-DIF在老龄和后肢去负荷骨质疏松小鼠的骨组织中高表达。进而设计制备长链非编码RNAlnc-DIF的RNA干扰序列，进行成骨分化功能实验发现：长链非编码RNAlnc-DIF抑制成骨细胞分化，并且lnc-DIF能够特异性结合成骨相关miR-489-3p。这表明长链非编码RNAlnc-DIF能够用于制备治疗各种因素引起的骨质疏松以及骨骼系统其他疾病的药物。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案：一种长链非编码RNAlnc-DIF的应用，其特点是包括以下步骤：首先设计lnc-DIF特异性引物序列，构建老龄小鼠骨质疏松模型和后肢去负荷骨质疏松小鼠模型；并检测lnc-DIF在骨组织中表达量，证实lnc-DIF在小鼠骨质疏松骨组织样本中高表达。设计、制备并进行化学修饰，获得lnc-DIF的RNA干扰序列；利用体外转染方法将RNA干扰序列转染到小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中，进行qPCR检测，以及ALP染色实验、矿化-茜素红s染色实验，证明长链非编码RNAlnc-DIF通过特异性结合miR-489-3p抑制成骨细胞分化。获得的lnc-DIF干扰序列能够用于制备治疗骨骼系统疾病的药物及药物组合物，骨骼系统疾病包括人骨质疏松、股骨头坏死、关节退行性变、脊柱侧弯以及其它骨骼系统疾病。所述药物及药物组合物包括药学上能够接受的一种或多种载体，包括但不限于稀释剂、粘合剂、吸附载体、填充剂和崩解剂；并能够用不同添加剂制备药物组合物，包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、PH控制剂及表面活性剂。所述lnc-DIF特异性引物序列如下：lnc-DIF上游引物：CCTGTGGAGGAAGGAAGATG。lnc-DIF下游引物：TCAGAAGGCTGGAGAGATGG。所述lnc-DIF的RNA干扰序列如下：lnc-DIFsiRNA：GGCAUGUAAUCUCUAGACATT。UGUCUAGAGAUUACAUGCCTT。本专利技术的有益效果是：该应用首先检测老龄骨质疏松小鼠模型股骨样本和后肢去负荷骨质疏松小鼠模型股骨样本，发现长链非编码RNAlnc-DIF在老龄和后肢去负荷骨质疏松小鼠的骨组织中高表达。进而设计制备长链非编码RNAlnc-DIF的RNA干扰序列，进行成骨分化功能实验发现：长链非编码RNAlnc-DIF抑制成骨细胞分化，并且lnc-DIF能够特异性结合成骨相关miR-489-3p。这表明长链非编码RNAlnc-DIF能够用于制备治疗各种因素引起的骨质疏松以及骨骼系统其他疾病的药物。下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作详细说明。附图说明图1是本专利技术应用lnc-DIF的干扰序列可有效抑制lnc-DIF在前成骨细胞MC3T3-E1中的表达结果图；证明本专利技术设计的lnc-DIF干扰序列可以有效降低前成骨细胞中lnc-DIF表达水平。(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，***P<0.001)。图2是本专利技术利用qPCR技术检测长链非编码RNAlnc-DIF在老龄骨质疏松小鼠模型和HLU后肢去负荷骨质疏松小鼠模型骨组织中低表达的结果图；证明lnc-DIF在骨组织中的表达量与骨质疏松具有相关性。(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，***P<0.001)。图3是本专利技术利用qPCR技术检测lnc-DIF的干扰序列可有效促进成骨分化标志基因ALP和ColI表达结果图；证明在前成骨细胞中，当lnc-DIF的表达量下降时，其成骨分化标志因子的表达量降低。(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种长链非编码RNA lnc‑DIF的应用，其特征在于包括以下步骤：首先设计lnc‑DIF特异性引物序列，构建老龄小鼠骨质疏松模型和后肢去负荷骨质疏松小鼠模型；并检测lnc‑DIF在骨组织中表达量，证实lnc‑DIF在小鼠骨质疏松骨组织样本中高表达；设计、制备并进行化学修饰，获得lnc‑DIF的RNA干扰序列；利用体外转染方法将RNA干扰序列转染到小鼠前成骨细胞MC3T3‑E1中，进行qPCR检测，以及ALP染色实验、矿化‑茜素红s染色实验，证明长链非编码RNA lnc‑DIF通过特异性结合miR‑489‑3p抑制成骨细胞分化；获得的lnc‑DIF干扰序列能够用于制备治疗骨骼系统疾病的药物及药物组合物，骨骼系统疾病包括人骨质疏松、股骨头坏死、关节退行性变、脊柱侧弯以及其它骨骼系统疾病；所述药物及药物组合物包括药学上能够接受的一种或多种载体，包括但不限于稀释剂、粘合剂、吸附载体、填充剂和崩解剂；并能够用不同添加剂制备药物组合物，包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、PH控制剂及表面活性剂。

【技术特征摘要】
1.一种长链非编码RNAlnc-DIF的应用，其特征在于包括以下步骤：首先设计lnc-DIF特异性引物序列，构建老龄小鼠骨质疏松模型和后肢去负荷骨质疏松小鼠模型；并检测lnc-DIF在骨组织中表达量，证实lnc-DIF在小鼠骨质疏松骨组织样本中高表达；设计、制备并进行化学修饰，获得lnc-DIF的RNA干扰序列；利用体外转染方法将RNA干扰序列转染到小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中，进行qPCR检测，以及ALP染色实验、矿化-茜素红s染色实验，证明长链非编码RNAlnc-DIF通过特异性结合miR-489-3p抑制成骨细胞分化；获得的lnc-DIF干扰序列能够用于制备治疗骨骼系统疾病的药物及药物组合物，骨骼系统疾病包括人骨质疏松、股骨头坏死、关节退行性变、脊柱侧弯以及其它骨骼系统...

【专利技术属性】
技术研发人员：骞爱荣，印崇，苗治平，张琰，胡丽芳，陈志浩，赵帆，李迪杰，马剑华，苏佩红，马小莉，仇伍霞，杨超飞，李思宇，王牌，
申请(专利权)人：西北工业大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61