长链非编码RNALOC401317的表达载体、抑瘤试剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种长链非编码RNA LOC401317的表达载体、抑瘤试剂及其应用，即用于制备抑制肿瘤细胞生长和增殖的制剂，根据该lncRNA序列，设计并合成了用于过表达LOC401317的真核表达载体，并将该载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米球，成功地在鼻咽癌细胞系中表达出LOC401317，抑制了鼻咽癌细胞的生长。本发明专利技术的多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒，可保护LOC401317载体免受核酸酶降解，延长作用时间，有更高的转染效率，有利于进一步的开发和应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNALOC401317的表达载体、抑瘤试剂及其应用。
技术介绍
鼻咽癌是常见高发的头颈部恶性肿瘤，容易发生颈部淋巴结转移，预后较差。研究表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，其中抑癌基因的失活与癌基因的激活发挥了关键的作用。TP53基因(编码p53蛋白)自1979年被克隆以来，一直是肿瘤分子生物学研究领域最引人注目的重要抑瘤基因之一。大量的证据表明，TP53基因通过调控一系列信号转导通路广泛参与了多种恶性肿瘤的发生发展。在细胞受到各种致癌因素的刺激时，p53蛋白激活并通过转录调控下游关键靶基因的表达，阻滞细胞周期、诱导细胞分化、启动细胞衰老及凋亡、参与DNA损伤修复维持基因组的稳定、调节能量代谢和抑制肿瘤血管生成，从而阻止肿瘤的发生发展。已有的研究发现，TP53基因是包括鼻咽癌在内的多种恶性肿瘤中最常见的突变基因之一，33％～76％的患者存在TP53基因异常。因此，恢复鼻咽癌中TP53基因功能或逆转其下游信号通路，对鼻咽癌的治疗具有重要的意义。长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类长度超过200nt、缺少特异完整的开放阅读框、无或很少有蛋白编码功能的RNAs分子。最近的研究表明，lncRNAs通过在表观遗传、转录和转录后水平广泛调节基因的表达，它们参与了生物体生长、发育、衰老及死亡等重要生命活动的调控。越来越多的研究表明lncRNAs的异常表达或功能缺失与肿瘤的发生发展密切相关。一些lncRNAs分子在肿瘤的诊断和治疗方面具有重要的意义，且可以作为肿瘤预后判断新的分子标记。目前，已经克隆的人类lncRNAs基因已超过4万多个，但绝大部分lncRNA的功能未知。为了寻找鼻咽癌中TP53基因调控的下游lncRNAs及其在鼻咽癌中的应用价值，我们在鼻咽癌细胞系中转染TP53基因，收集不同时间点的细胞用新一代lncRNAs芯片检测了已知lncRNA的表达水平。芯片检测的结果显示，lncRNA LOC401317的表达差异最显著，其表达明显上调，提示LOC401317可能具有抑瘤基因的作用。我们构建了表达LOC401317的真核表达载体，转染到鼻咽癌细胞株中，在体外培养系统和裸鼠移殖瘤体内模型中均证实lncRNA LOC401317可明显抑制鼻咽癌细胞的增殖，抑制肿瘤细胞的生长，因此LOC401317是一个新的抑瘤性lncRNA。将LOC401317真核表达载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒，可保护LOC401317载体免受核酸酶降解，延长作用时间，且有更高的转染效率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供长链非编码RNALOC401317的表达载体、抑瘤试剂及其应用。利用LOC401317序列得到的载体可以制备抑制鼻咽癌细胞的制剂。长链非编码RNA LOC401317的应用方法，用于制备抑制鼻咽癌细胞的制剂，该长链非编码RNA LOC401317的序列见SEQ NO:1。抑制鼻咽癌细胞的制剂为长链非编码RNA LOC401317的表达载体。可以将所述的表达载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米球。具体是选择Nhe I和EcoR I酶切位点用于酶切pcDNA3.1载体，并将LOC401317序列插入该位点，得到长链非编码RNA LOC401317的表达载体；将多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒与长链非编码RNA LOC401317的表达载体混合静置。构建长链非编码RNA LOC401317的表达载体步骤如下：1)以转染TP53基因质粒的HNE2细胞的cDNA为模板，利用TaKaRa LA酶进行PCR扩增全长LOC401317序列；LOC401317全长序列扩增引物如下：上游引物：5’-atcgggggtgtgtgtttgcct-3’下游引物：5’-tgacgtaatggacctgtatcc-3’在上、下游引物的5’端分别加上限制性内切酶Nhe I和EcoR I识别位点及保护碱基后，引物序列如下：上游引物：5’-AGGAGCTAGC atcgggggtgtgtgtttgcc-3’下游引物：5’-ATGCGAATTC tgacgtaatggacctgtatcc-3’；2)PCR反应条件如下：PCR反应步骤：5返回到第2步，共进行39次反应循环3)将PCR产物电泳、胶回收目的片段后经Nhe I和EcoR I双酶切后电泳，再次胶回收；4)pcDNA3.1质粒经Nhe I和EcoR I双酶切后电泳胶回收目的片段；5)以T4DNA连接酶连接4)和5)步胶回收产物，即可得到用于真核表达lncRNA LOC401317的载体质粒；6)将第5)步得到的包含LOC401317全长序列的pcDNA3.1真核表达质粒转化感受态大肠杆菌，以扩增质粒。多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒是运用OP-10、环己烷、氨水的微乳液自组装技术进行硅纳米颗粒的合成，并利用硅纳米颗粒的表面能和离子静电作用进行多聚赖氨酸表面修饰，制备得到。制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒具体如下：1)将OP-10、环己烷和氨水混合，室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯，继续搅拌至聚合完成，加入等体积丙酮，超声分散，离心，双蒸水洗涤三次，离心收集沉淀于80℃干燥，研细得粒径范围10-50nm的硅纳米颗粒；其中H2O与OP-10及H2O与正硅酸异酯的摩尔比为2～10、氨水浓度为1.6～28％、正硅酸异酯在环己烷中的摩尔浓度为0.1～3mol/L；2)将硅纳米颗粒按0.1～10mg/ml重悬于0.6M NaCO3溶液中，超声分散，离心，弃上清，再将沉淀物按0.1～10mg/ml重悬于pH 7.4的PBS中，超声分散，加多聚赖氨酸，终浓度为4～15nmol/mL，充分混匀，室温混摇；离心，弃上清，沉淀按0.1～10mg/ml重悬于双蒸水中，得到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒。最后将多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒超声分散，每毫升纳米颗粒悬液加入10～50ug长链非编码RNA LOC401317的表达载体，混合，室温静置使其结合；得到长链非编码RNALOC401317表达载体负载的多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成的纳米球。基于长链非编码RNALOC401317的抑瘤试剂，其特征在于，将权利要求9所述的长链非编码RNA LOC401317的表达载体与多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒混合静置得到；多聚赖本文档来自技高网...

【技术保护点】
长链非编码RNA LOC401317的应用方法，其特征在于，用于制备抑制鼻咽癌细胞的制剂，该长链非编码RNA LOC401317的序列见SEQ NO:1。

【技术特征摘要】
1.长链非编码RNA LOC401317的应用方法，其特征在于，用于制备抑制鼻咽癌细胞的
制剂，该长链非编码RNA LOC401317的序列见SEQ NO:1。
2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，抑制鼻咽癌细胞的制剂为长链非编码
RNA LOC401317的表达载体。
3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，将所述的表达载体负载到多聚赖氨酸
修饰的硅纳米颗粒上制成纳米球。
4.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，
选择Nhe I和EcoR I酶切位点用于酶切pcDNA3.1载体，并将LOC401317序列插入该
位点，得到长链非编码RNA LOC401317的表达载体；将多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒与长
链非编码RNA LOC401317的表达载体混合静置。
5.根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于，
构建长链非编码RNA LOC401317的表达载体步骤如下：
1)以转染TP53基因质粒的HNE2细胞的cDNA为模板，利用TaKaRa LA酶进行
PCR扩增全长LOC401317序列；
LOC401317全长序列扩增引物如下：
上游引物：5’-atcgggggtgtgtgtttgcct-3’
下游引物：5’-tgacgtaatggacctgtatcc-3’
在上、下游引物的5’端分别加上限制性内切酶Nhe I和EcoR I识别位点及保护碱基后，
引物序列如下：
上游引物：5’-AGGAGCTAGC atcgggggtgtgtgtttgcc-3’
下游引物：5’-ATGCGAATTC tgacgtaatggacctgtatcc-3’；
2)PCR反应条件如下：
PCR反应步骤：
5返回到第2步，共进行39次反应循环
3)将PCR产物电泳、胶回收目的片段后经Nhe I和EcoR I双酶切后电泳，再次胶回收；
4)pcDNA3.1质粒经Nhe I和EcoR I双酶切后电泳胶回收目的片段；
5)以T4DNA连接酶连接4)和5)步胶回收产物，即可得到用于真核表达lncRNA
LOC401317的载体质粒；
6)将第5)步得到的包含LOC401317全长序列的pcDNA3.1真核表达质粒转化感受态大
肠杆菌，以扩增质粒。
6.根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于，
多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒是运用OP-10、环己烷、氨水的微乳液自组装技术进行硅
纳米颗粒的合成，并利用硅纳米颗粒的表面能和离子静电作用进行多聚赖氨酸表面修饰，制
备得到。
7.根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于，制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒：
1)将OP-10、环己烷和氨水混合，室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯，继续搅拌至聚合完
成，加入等体积丙酮，超声分散，离心，双蒸水...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊炜，李桂源，曾朝阳，龚朝建，李小玲，廖前进，陈攀，曾勇，张姗姗，向娟娟，周艳宏，李征，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43