本发明专利技术公开了一种黄颡鱼生长特性相关的微卫星标记及其检测和应用；即在黄颡鱼GH序列上找到4个微卫星位点，通过筛选特异引物扩增微卫星位点，分析其与生长性状的关联性，找到对生长性状有利的优势基因型。结果表明其中有三个位点与生长性状有显著或极显著相关，位点GA与体重、体长、体高、体厚有显著关联，与全长、尾柄高有极显著关联，其中CD为优势基因型；位点TCTT与头长、尾柄高有显著关联，其中BD为优势基因型；位点AC与体厚、头长有显著关联，其中DD为优势基因型，利用本发明专利技术所述引物扩增得到的4个微卫星位点都具有较高的遗传多样性，且与生长性状有着显著或极显著的关联性，本发明专利技术对于分子育种实践具有十分重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子标记遗传育种
，更具体地，涉及一种黄颡鱼生长特性相关的微卫星标记及其检测和应用。
技术介绍
黄颡鱼是我国广泛养殖的小型淡水经济鱼类；因其肉质细嫩、营养丰富、含肉率高深受消费者欢迎，黄颡鱼繁殖亲本主要是野生捕捞或培养数代的种群，没有经过人工选育，其生长速度、抗病能力和养殖性能较弱，因此开展黄颡鱼的两种选育工作具有实际的意义。目前已有许多学者在黄颡鱼遗传育种方面进行了大量的研究，并取得了不少成果。随着生物技术的发展，鱼类遗传育种技术有了越来越多的方法，分子标记主要是指能够反映个体生物或群体间基因组中某些差异性的基因片段，具有多态性高、分布广泛、共显性等一系列优势，在鱼类遗传育种和遗传连锁图谱构建、亲缘关系鉴定、种质资源研究等方面具有广泛的应用。微卫星标记（microsatellite），又称为短串联重复序列（short tandem repeats，STRs）或简单重复序列（SSRs），是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富。每个微卫星DNA 都由核心序列和侧翼序列组成，其核心序列呈串联重复排列，侧翼DNA 序列位于核心序列的两端，为保守的特异单拷贝序列，能使微卫星特异地定位于染色体常染色质区的特定部位。微卫星标记是以PCR为基础的第二代分子标记，迄今为止，微卫星标记技术在重要经济鱼类已得到广泛的应用，成为研究群体遗传多样性、群体遗传结构、遗传图谱构建、功能基因定位及 QTL 分析等的一项重要技术。利用分子标记培育生长性状优良的高产品种是提高经济效益的重要途径之一，获得与黄颡鱼生长特性相关的基因及基因位点可辅助高产黄颡鱼的选育，目前还没有与黄颡鱼生长特性相关的基因及基因位点的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种与黄颡鱼生长特性相关的微卫星标记。本专利技术的第二个目的是提供用于特异性检测上述微卫星标记的引物。本专利技术的第三个目的是提供上述微卫星标记的应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的：一种用于扩增与黄颡鱼生长特性相关的微卫星的引物，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4～9所示，其中，引物SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5扩增的微卫星片段的重复基序为（GA）n1，n1的取值范围为17～35，所述微卫星片段与黄颡鱼的体重、全长、体长、体高、体厚、尾柄高相关；引物SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7扩增的微卫星片段的重复基序为（TCTT）n2，n2的取值范围为6～14，所述微卫星片段与黄颡鱼的头长、尾柄高相关；引物SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9扩增的微卫星片段的重复基序为（AC）n3，n3的取值范围为25～35，所述微卫星片段与黄颡鱼的体厚、头长相关。优选地，引物SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5扩增的微卫星片段的溶解温度为56℃，片段大小为311bp；引物SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7扩增的微卫星片段的溶解温度为61℃，片段大小为272bp，引物SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9扩增的微卫星片段的溶解温度为56℃，片段大小为220bp。申请人通过研究发现，用上述微卫星引物扩增样本，能特异的扩增出微卫星标记（或者叫做微卫星位点），这些微卫星标记与黄颡鱼的生长形状密切相关，因此可用于黄颡鱼的分子育种。本专利技术还提供含有所述微卫星引物的试剂盒。根据本专利技术实施例，可以通过检测上述微卫星标记，能够有效的确定黄颡鱼的全长性状，因此，本专利技术还提供所述微卫星引物或者所述试剂盒在黄颡鱼遗传育种中的应用。本专利技术还提供一种检测黄颡鱼全长性状的方法，包括以下步骤：S1. 提取样本DNA；S2. 利用权利要求1或2所述SEQ ID NO：4～9的引物扩增样本DNA，分析样本DNA中微卫星标记的类型和基因型，确定黄颡鱼的全长性状。本专利技术还提供一种选育优良黄颡鱼的方法，包括以下步骤：S1. 提取样本DNA；S2. 利用权利要求1或2所述SEQ ID NO：4～9的引物扩增样本DNA，分析样本DNA中微卫星标记的类型和基因型；S3. 结果判断：若样本DNA中含重复基序（GA）n1，则选择基因型为CD的样本为优良黄颡鱼；若样本DNA中含重组基序（TCTT）n2，则选择基因型为BD的样本为优良黄颡鱼；若样本DNA中含重复基序（AC）n3，则选择基因型为DD的样本为优良黄颡鱼。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次获得黄颡鱼GH基因全长序列，通过SSRHunter软件在GH序列上查找到4个微卫星位点，通过SAS软件GLM模型首次分析黄颡鱼微卫星位点与生长性状的关联性，经方差分析检验呈显著性差异的位点，利用 Duncan 法对显著性差异位点的基因型进行多重比较，找到对生长性状有利的优势基因型。检验结果为：其中有三个位点与生长性状有显著或极显著相关，位点GA与体重、体长、体高、体厚有显著关联，与全长、尾柄高有极显著关联，其中CD为优势基因型；位点TCTT与头长、尾柄高有显著关联，其中BD为优势基因型；位点AC与体厚、头长有显著关联（P＜0.05），其中DD为优势基因型，本试验的微卫星位点与生长性状有显著关联性的概率更大，这可能由于新发现的4个微卫星位于GH基因上，其多态性对黄颡鱼的生长发育有着直接的影响。本研究发现的4个微卫星位点都具有较高的遗传多样性，且位点GA、TCTT、AC都与生长性状有着显著或极显著的关联性，本专利技术对于分子育种实践具有十分重要的意义。附图说明图1为普通扩增PCR结果，其中，图1（1）为位点AT、GA引物电泳结果；图1（2）为位点TCTT、AC引物电泳结果；最左条带为MarkerDL2000，从上至下条带大小分别2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。图2为微卫星分子标记PCR产物在ABI3730xl上的分型结果；其中，图1（1）为AT位点分型；1（2）为GA位点分型；1（3）为TCTT位点分型；1（4）为AC位点分析。具体实施方式下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。本专利技术采用同源克隆的方法获得黄颡鱼GH全长（序列如SEQ ID NO：1所示），共3117bp，5个外显子（从5’端开始分别称为外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和外显子5），4个内含子（从5’端开始分别称为内含子1、内含子2、内含子3、内含子4），5’UTR为165bp，3’UTR为485bp。实施例1 微卫星位点的筛选及分型利用SSRHunter软件搜索黄颡鱼GH基因全长序列中的微卫星位点，确定微卫星位点类型、所在位置及长度等信息。采用Primer Premier 5.0 软件在SSRs位点上下游150bp左右设计上下游引物。引物信息见表1。为了实现微卫星多态性的荧光半自动检测，需要对普通引物的5’或者3’端本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于扩增与黄颡鱼生长特性相关的微卫星的引物，其特征在于，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4～9所示，其中，引物SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5扩增的微卫星片段的重复基序为（GA）n1，n1的取值范围为17～35，所述微卫星片段与黄颡鱼的体重、全长、体长、体高、体厚、尾柄高相关；引物SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7扩增的微卫星片段的重复基序为（TCTT）n2，n2的取值范围为6～14，所述微卫星片段与黄颡鱼的头长、尾柄高相关；引物SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9扩增的微卫星片段的重复基序为（AC）n3，n3的取值范围为25～35，所述微卫星片段与黄颡鱼的体厚、头长相关。
【技术特征摘要】
1.一种用于扩增与黄颡鱼生长特性相关的微卫星的引物，其特征在于，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4～9所示，其中，引物SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5扩增的微卫星片段的重复基序为（GA）n1，n1的取值范围为17～35，所述微卫星片段与黄颡鱼的体重、全长、体长、体高、体厚、尾柄高相关；引物SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7扩增的微卫星片段的重复基序为（TCTT）n2，n2的取值范围为6～14，所述微卫星片段与黄颡鱼的头长、尾柄高相关；引物SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9扩增的微卫星片段的重复基序为（AC）n3，n3的取值范围为25～35，所述微卫星片段与黄颡鱼的体厚、头长相关。2. 根据权利要求1所述的用于黄颡鱼生长特性分析的微卫星引物，其特征在于，引物SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5扩增的微卫星片段的溶解温度为56℃，片段大小为311bp；引物SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7扩增的微卫星片段的溶解温度为61℃，片段大小为272b...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘文生，李美娟，朱雯璐，王娟，廖良源，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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