基于MLPA+Seq的高通量测序的肿瘤检测方法技术

本发明专利技术提供了一种基于MLPA+Seq的高通量测序的肿瘤检测方法，包括如下步骤：(1)制备基因组DNA；(2)设计探针；(3)探针与基因组DNA进行杂交，并使用DNA连接酶进行连接；(4)将步骤(3)的产物与引物进行PCR反应；(5)将PCR产物纯化后进行测序，通过生物信息学方法确定DNA的拷贝数和碱基变异，计算杂合体的碱基结合频率。本申请的方法可同时检测多个位点，且建库时的成本低，操作方便，准确度高，特异性强。

High throughput sequencing based tumor detection method based on MLPA+Seq

The present invention provides a method for detecting tumor based on high throughput sequencing of MLPA+Seq: (1) preparation of genomic DNA; (2) design probe; (3) hybridization with genomic DNA by probe, and connection with DNA ligase; (4) PCR reaction of the product of step (3) with primers; (5) purify PCR products after purification After sequencing, the copy number and base variation of DNA were determined by bioinformatics method, and the base binding frequency of heterozygote was calculated. The method can detect multiple sites simultaneously, and has low cost, convenient operation, high accuracy and high specificity.

【技术实现步骤摘要】
基于MLPA+Seq的高通量测序的肿瘤检测方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种基于MLPA+Seq的高通量测序的肿瘤检测方法。
技术介绍
MRC-Hollandb.v.公司开发的多重连接依赖性探针扩增技术(multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA)，即MLPA技术，利用简单的杂交(hydriation)、连接(ligation)及PCR扩增(PCRamplication)反应，在一个反应中可同时检测45种基因拷贝数变异(Copynumbervariations，CNV)，单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNP)，还可用于基因的甲基化检测和mRNA分析。MLPA检测技术基于毛细管电泳，为区别出各探针，需将各探针片段大小至少相差4bp，这就限制了多重效果只能是45重，且只是半定量的检测核苷酸序列的变化，其灵敏性不高。SNP是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，SNP在疾病诊断方面是一个强有力的工具，研究发现SNP在基因组中分布相当广泛，SNP变异与各种疾病，如肿瘤的发生相关，因此在疾病筛查中筛选与肿瘤相关的SNP变异有重要意义。博奥生物集团有限公司提供了一种基于高通量测序的SNP的检测方法，其基本原理是先设计探针和预扩增的引物对，预扩增引物的5’端均标记biotin，先扩增出预设的片段，之后就是将探针库与预扩增片段杂交，用磁珠捕获杂交产物，用DNA连接酶连接杂交产物，高温变性，解离双链，用带接头的通用引物扩增目的片段。此方法虽能降低预扩增中的非特异扩增，但加入了这一轮PCR后，随后再次进行PCR时有可能引起模板间的随机突变。由于现有技术的检测基于毛细管电泳，所以需将各探针片段大小至少相差4bp，这就限制了多重效果只能是45重，且通过毛细管电泳只能半定量的检测核苷酸序列的变化，其灵敏性不高。现有的二代高通量测序的流程包括DNA的提取、DNA的片段化、片段筛选和文库构建、上机测序、数据分析，在此过程中需要的模板起始量高，即对DNA的质量要求较高。因此，现有技术的成本均相对较高。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于MLPA+Seq的高通量测序的肿瘤检测方法，用MLPA的方法进行建库，建库时只需让探针与模板完全杂交，用DNA连接酶进行连接后，再用DNA聚合酶，用通用的一重引物起到多重扩增的效果来构建文库，最终用二代测序的方法进行上机。本专利技术的目的是通过以下方案实现：一种基于MLPA+Seq的高通量测序的肿瘤检测方法，包括如下步骤：(1)制备基因组DNA；(2)设计探针；(3)探针与基因组DNA进行杂交，并使用DNA连接酶进行连接；(4)将步骤(3)的产物与引物进行PCR反应；(5)将PCR产物纯化后进行测序，通过生物信息学方法确定DNA的拷贝数和碱基变异，计算杂合体的碱基结合频率；所述步骤(3)中的探针包括左探针和右探针；所述左探针包括5’通用接头序列和3’特异杂交序列，右探针包括经磷酸化修饰的5’特异杂交序列和3’通用接头序列。优选地，所述步骤(1)中制备基因组DNA的方法为采用天根的磁珠法提取血液的基因组DNA；具体步骤如下：①200μl血样+200μl裂解液BL+20μl蛋白酶K，振荡，70℃孵育15min，每7min振荡一次；②加入450μl的无水乙醇+30μl磁珠，翻转10min或静置10min，每3min振荡一次；③放于磁力架中，弃上清，加入700μl洗涤液BW1，反复颠倒，弃上清；④加入800μl洗涤液，反复颠倒，弃上清；⑤加入800μl的80％乙醇，反复颠倒，弃上清；⑥室温干燥5-10min；⑦加入60μl洗脱液CE，56℃孵育10min，第5min振荡；⑧吸取上清于新的1.5ml的EP管中。优选地，所述步骤(2)中的探针信息如表1所示：表19对探针的序列信息优选地，所述步骤(3)的杂交温度为从60℃到25℃梯度退火，每4min降1℃；DNA连接酶选自T4DNALigase，T3DNALigase，TaqDNALigase，T7DNAligase和Ligase-65的任一种，37℃连接1h后，使用0.8×VAHTSTMDNACleanBeads纯化磁珠纯化。优选地，所述步骤(4)中的通用引物中包含的通用接头序列及通用引物如下：5’端通用接头：CCTACACGACGCTCTTCCGATCT；3’端通用接头：TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAAC；通用引物：P5端通用引物：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5barcode]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；P7端通用引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(i7barcode)GTGATGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA。优选地，所述PCR体系如下：加入gDNA模板的终质量为150ng，加入探针mix的量为2μl，加入TaqDNALigaseBuffer的量为2μl，此体系用水补到10μl，即先进行模板的变性，再进行探针与模板的杂交，杂交完成后再在此体系中加入TaqDNALigase0.2μl，水9.8μl，总体积为20μl；37℃连接1h；连接完成后使用0.8×VAHTSTMDNACleanBeads纯化连接产物，具体步骤如下：①将磁珠液提前30min从2-8℃取出，静置使其温度平衡至室温；②颠倒或旋涡振荡使磁珠液充分混匀，吸取16μl磁珠液加入DNA样品中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀；③室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上；④将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；⑤保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30s，小心移除上清；⑥重复步骤⑤一次，总计漂洗二次；⑦保持样品始终处于磁力架上，室温下开盖干燥磁珠约5-10min；⑧将样品从磁力架上取出，加入12μlH2O，涡旋振荡或使用移液器吹打充分混匀，室温静置2min；在磁力架上静置5min，待溶液澄清后，小心吸取上清10μl至一个新的EP管中；Q5酶的扩增体系如下：Q5HotStartHigh-Fidelity2×MasterMix：10μl；纯化产物9.5μl，引物mix0.5μl。优选地，所述PCR条件如下：先在98℃变性模板基因组10min，再从60℃梯度退火到25℃，条件为每4min降1℃，降到25℃加入TaqDNALigase和水，在37℃连接1h；使用Q5酶扩增时的程序如下：98℃30s；98℃10s；55℃30s；72℃15s，循环30轮；72℃5min，4℃+∞。优选地，所述PCR反应中的DNA聚合酶包括Q5HotStartHigh-Fidelity2×MasterMix、2×KAPAHiFiHotStarReadyMix和Pfusionpolymerase。优选地，所述步骤(5)中的纯化采用1.5×VAHTSTMDNACleanBeads磁珠进行纯化。优选地，所述步骤(5)中的测序平台包括illuminaHiSeq、MiSeq、NextSeq测序平台、LifeIon测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于MLPA+Seq的高通量测序的肿瘤检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备基因组DNA；(2)设计探针；(3)探针与基因组DNA进行杂交，并使用DNA连接酶进行连接；(4)将步骤(3)的产物与引物进行PCR反应；(5)将PCR产物纯化后进行测序，通过生物信息学方法确定DNA的拷贝数和碱基变异，计算杂合体的碱基结合频率；所述步骤(3)中的探针包括左探针和右探针；所述左探针包括5’通用接头序列和3’特异杂交序列，右探针包括经磷酸化修饰的5’特异杂交序列和3’通用接头序列。

【技术特征摘要】
1.一种基于MLPA+Seq的高通量测序的肿瘤检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备基因组DNA；(2)设计探针；(3)探针与基因组DNA进行杂交，并使用DNA连接酶进行连接；(4)将步骤(3)的产物与引物进行PCR反应；(5)将PCR产物纯化后进行测序，通过生物信息学方法确定DNA的拷贝数和碱基变异，计算杂合体的碱基结合频率；所述步骤(3)中的探针包括左探针和右探针；所述左探针包括5’通用接头序列和3’特异杂交序列，右探针包括经磷酸化修饰的5’特异杂交序列和3’通用接头序列。2.根据权利要求1所述的基于MLPA+Seq的高通量测序的肿瘤检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中制备基因组DNA的方法为采用天根的磁珠法提取血液的基因组DNA；具体步骤如下：①200μl血样+200μl裂解液BL+20μl蛋白酶K，振荡，70℃孵育15min，每7min振荡一次；②加入450μl的无水乙醇+30μl磁珠，翻转10min或静置10min，每3min振荡一次；③放于磁力架中，弃上清，加入700μl洗涤液BW1，反复颠倒，弃上清；④加入800μl洗涤液，反复颠倒，弃上清；⑤加入800μl的80％乙醇，反复颠倒，弃上清；⑥室温干燥5-10min；⑦加入60μl洗脱液CE，56℃孵育10min，第5min振荡；⑧吸取上清于新的1.5ml的EP管中。3.根据权利要求1所述的基于MLPA+Seq的高通量测序的肿瘤检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中的探针信息如表1所示：表19对探针的序列信息4.根据权利要求1所述的基于MLPA+Seq的高通量测序的肿瘤检测方法，其特征在于，所述步骤(3)的杂交温度为从60℃到25℃梯度退火，每4min降1℃；DNA连接酶选自T4DNALigase，T3DNALigase，TaqDNALigase，T7DNAligase和Ligase-65的任一种，37℃连接1h后，使用0.8×VAHTSTMDNACleanBeads纯化磁珠纯化。5.根据权利要求1所述的基于MLPA+Seq的高通量测序的肿瘤检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中的通用引物中包含的通用接头序列及通用引物如下：5’端通用接头：CCTACACGACGCTCTTCCGATCT；3’端通用接头：TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAAC；通用引物：P5端通用引物：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5barcode]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；P7端通用引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(i7barcode)GTGATGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA。6.根据权利要求5所述的基于MLPA+Seq的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张嫒媛，肖哲，焦少灼，丁学芬，戚珠云，王云鹏，王琦童，周慧，
申请(专利权)人：美因健康科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11