皮肤性状相关基因的多重PCR检测方法技术

本发明专利技术提供了一种皮肤性状相关基因的多重PCR检测方法，包括如下步骤：(1)设计引物组合；(2)第一次PCR扩增后磁珠纯化产物；(3)将步骤(2)纯化后的产物进行第二次PCR扩增，并对扩增产物进行磁珠纯化；(4)将步骤(3)纯化后的产物进行二代测序。本发明专利技术的方法解决了多重PCR技术检测这些与皮肤特性相关位点的扩增效果问题，可以显著降低检测成本和增加检测效果。

【技术实现步骤摘要】
皮肤性状相关基因的多重PCR检测方法
本专利技术涉及基因检测，尤其涉及一种皮肤性状相关基因的多重PCR检测方法。
技术介绍
随着人们生活水平的提高，对护肤品的需要日益增加。除了生活环境、护理程度等外在因素影响，基因对人的皮肤特性有着重要的影响，甚至直接决定了皮肤的特性。基因的一些重要位点存在着单碱基突变(SNP)。某个位点的碱基突变后会形成不同的基因型，不同的基因型往往会决定不同的皮肤特性。通过检测自身的具体基因型，可以更有效的根据自身特点选择护肤品，从而可以更有针对性的进行护肤。对于基因单碱基突变的检测目前有多种技术，常见的技术如下：1.一代测序法：基于一代测序原理来检测样本的基因型。优点是在常规方法中准确度最高。缺点是成本高，检测通量很低。适合少量样本或少量位点的检测。2.Taqman之类的终点荧光法主要是利用两种不同颜色的荧光标记相应两种基因型的探针，通过读取PCR反应后两种颜色荧光的比值确定样本的基因型。此类技术的优点是操作简单，检测时间短，检测通量高，结果较为准确，检测位点数目少时成本低。缺点是检测位点数目多时成本高，样本量少时检测效果差。3.基于芯片的检测主要是利用DNA互补配对原理，和芯片上已知基因型的序列杂交，根据芯片上各已知基因型的荧光信号有无和强弱来判断样本基因型。此类技术的优点是检测通量高，适合数目非常多的位点(几十万-上百万的位点)的检测。缺点是操作复杂，检测周期长，检测位点数目少时成本高，准确性相对较低。4.基于酶切的RFLP技术主要是利用突变前后的两种基因型，其中一种可以被特定的限制性内切酶识别并切断，而另外一种不能被限制性内切酶识别并切断。通过凝胶电泳或者毛细管电泳对酶切后的片段是否存在相应基因型的片段，从而判断样本基因型。该技术的优点是操作简单，成本低，无需特殊或者价格高昂的专用仪器设备。缺点是检测通量低，对位点要求高(不能形成酶切位点的突变无法检测)，因为酶切不完全会存在假阳性。5.质谱法利用PCR扩增出的不同基因型产物的碱基分子量和电荷数不同，从而导致不同的基因型产物具有不同的核质比，通过质谱仪区分两种核质比的产物来确定样本的基因型。该技术的优点是灵敏度高，通量大，样品数量大时成本低。缺点是目的位点附近的位点如果也有突变，那么就会是检测结果不准确，对样品质量要求高，如果有检测失败的样品，重新检测比较麻烦。6.基于多重PCR的二代测序法通过多重PCR法将目的位点和附近的序列进行扩增，然后纯化后利用二代测序技术对突变位点测序，从而确定样本的基因型。该技术的优点是准确性仅次于一代测序，通量大，检测位点数中等(几十-几百个)的时候成本低。缺点是位点数目少时成本高，引物设计难度高。7.基于MLPA技术的二代测序法利用MLPA技术将目的位点和附近的序列进行扩增，然后将产物纯化并利用二代测序技术对突变位点测序，从而确定样本的基因型。优点是通量大，准确性高，检测位点数中等时(几十-几百位点)成本低。缺点是位点数目少时成本高，对位点附近的序列依赖性高。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种皮肤性状相关基因的多重PCR检测方法。本专利技术的目的是通过以下方案实现：一种皮肤性状相关基因的多重PCR检测方法，包括如下步骤：(1)设计引物组合；(2)第一次PCR扩增后磁珠纯化产物；(3)将步骤(2)纯化后的产物进行第二次PCR扩增，并对扩增产物进行磁珠纯化；(4)将步骤(3)纯化后的产物进行二代测序。优选地，所述步骤(2)中第一次PCR扩增引物组合如表1：表1第一次PCR扩增的引物组合优选地，所述步骤(2)扩增体系为PlatinumTMMultiplexPCRMasterMix：15uL；待检测DNA样品：3uL；引物：6uL；H2O：6uL；将扩增体系中各组分的混合均匀，放到PCR仪上；所述各引物浓度均为1uM；所述PlatinumTMMultiplexPCRMasterMix为thermofisher，货号为4464268。优选地，所述步骤(2)中PCR条件如下：95℃2分钟；96℃30秒，58℃4分钟，17个循环；4℃直到取出产物。优选地，所述步骤(2)中的磁珠纯化是指在PCR产物中加入15uL磁珠混合均匀，静置2分钟后置于磁力架上2分钟，将上清移到新的离心管中，并加入15uL磁珠混合均匀，静置2分钟后置于磁力架上2分钟，弃去上清，加入100uL浓度为75％的乙醇溶液到离心管中，在磁力架上错位移动离心管清洗磁珠，然后弃去乙醇溶液，待磁珠快干燥时，从磁力架上取下离心管，加入10uL超纯水混匀磁珠以便洗脱DNA，混匀后静置2分钟，置于磁力架上2分钟，吸取9uL上清溶液备用。优选地，所述步骤(3)中PCR扩增的引物如表2所示：表2第二次扩增的引物序列优选地，所述步骤(3)中第二次PCR扩增体系为热启动超保真2XMasterMix：10uL；纯化后的PCR产物：9uL；扩增引物的浓度均为4uM：每种引物各0.5uL；将扩增体系中各组分的混合均匀，放到PCR仪上。优选地，所述步骤(3)中PCR条件如下：98℃30秒；98℃10秒，63℃30秒，72℃1分钟，9个循环；72℃5分钟；4℃直到取出产物。优选地，所述步骤(3)中纯化是指在第二次PCR产物中加入16uL磁珠混合均匀，静置2分钟后置于磁力架上2分钟，弃去上清，加入100uL浓度为75％的乙醇溶液到离心管中，在磁力架上错位移动离心管清洗磁珠，然后弃去乙醇溶液，待磁珠快干燥时，从磁力架上取下离心管，加入20uL超纯水混匀磁珠以便洗脱DNA，混匀后静置2分钟，置于磁力架上2分钟，吸取19uL上清溶液到新的离心管中备用。优选地，所述步骤(4)的二代测序是指基于illumina平台的二代测序方法。本专利技术的方法的优点：本检测设计的位点有近百个，而且会涉及到大量样本的检测，所以需要选择一个对于检测近百个位点成本低的技术，而且该技术必须具备高通量的特点。多重PCR的方案，其中难点和重点是在引物的设计，一个根据目前研究报道的文献查询到的与皮肤特性相关的重要位点有上百个，综合考虑检测通量，检测成本和其他因素考虑，基于多重PCR方式的二代测序方法是最适合的。从检测位点数和检测通量来考虑：除了芯片，多重PCR和MLPA技术外，其他技术在可接受的成本内，基本是针对几个或者几十个位点检测的，对于上百个位点的基因型检测并不是很合适。而且其他技术有很多在可接受成本内无法做高通量检测。再从检测成本考虑：芯片技术优势在于检测几万甚至上百万的位点成本优势明显，而对于上百个位点来说，和多重PCR，MLPA技术相比检测成本较高。最后从技术难易程考虑：MLPA技术对于位点附近序列的依赖性比多重PCR高，灵活性没有多重PCR高。所以只要解决了多重PCR的引物设计难题，综合考虑来看是最适合用来做上百个位点的皮肤特性相关位点的检测。好的引物组合，可以明显增加，建库成功率、降低测序成本和提高测序效果。本申请通过多次实验，设计出来一组扩增效果良好的引物组合。解决了多重PCR技术检测这些与皮肤特性相关位点的扩增效果问题，可以显著降低检测成本和增加检测效果。二代测序技术有基于几种不同原理的平台，各有其独特的优点和缺点。主流的有Illumina公司基于可逆合成终止原理的一系列测序仪，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种皮肤性状相关基因的多重PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)设计引物组合；(2)第一次PCR扩增后磁珠纯化产物；(3)将步骤(2)纯化后的产物进行第二次PCR扩增，并对扩增产物进行磁珠纯化；(4)将步骤(3)纯化后的产物进行二代测序。

【技术特征摘要】
1.一种皮肤性状相关基因的多重PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)设计引物组合；(2)第一次PCR扩增后磁珠纯化产物；(3)将步骤(2)纯化后的产物进行第二次PCR扩增，并对扩增产物进行磁珠纯化；(4)将步骤(3)纯化后的产物进行二代测序。2.根据权利要求1所述的皮肤性状相关基因的多重PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中第一次PCR扩增引物组合如表1：表1第一次PCR扩增的引物组合3.根据权利要求1或2任一所述的皮肤性状相关基因的多重PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(2)扩增体系为PlatinumTMMultiplexPCRMasterMix：15uL；待检测DNA样品：3uL；引物：6uL；H2O：6uL；将扩增体系中各组分的混合均匀，放到PCR仪上；所述各引物浓度均为1uM；所述PlatinumTMMultiplexPCRMasterMix为thermofisher，货号为4464268。4.根据权利要求3所述的皮肤性状相关基因的多重PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR条件如下：95℃2分钟；96℃30秒，58℃4分钟，17个循环；4℃直到取出产物。5.根据权利要求4所述的皮肤性状相关基因的多重PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中的磁珠纯化是指在PCR产物中加入15uL磁珠混合均匀，静置2分钟后置于磁力架上2分钟，将上清移到新的离心管中，并加入15uL磁珠混合均匀，静置2分钟后置于磁力架上2分钟，弃去上清，加入100uL浓度为75％的乙醇溶液到离心管中，在磁力架上错位移动离心管清洗磁珠，然后弃去...

【专利技术属性】
技术研发人员：戚珠云，肖哲，焦少灼，禹黎，尹朝华，
申请(专利权)人：美因健康科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11