鸡胡须性状的基因型快速鉴定方法技术

本发明专利技术提供一种鸡胡须性状的基因型快速鉴定方法。本发明专利技术根据鸡胡须基因在基因组上存在CNV的拷贝数位置变化，设计用于鉴别鸡胡须性状基因型的PCR引物组合，利用常规PCR、电泳技术和PCR产物条带亮度识别直接鉴定基因型，开发出一种简单、快速、准确鉴定鸡胡须基因的分型方法，可加快选育具有胡须特征鸡种的育种进程，缩短胡须鸡育种时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学及遗传育种领域，具体地说，涉及鸡胡须性状的基因型快速鉴定方法。
技术介绍
中国是世界上家禽遗传资源最丰富的国家之一，家鸡的羽毛和性状特征多样性丰富，常被作为某些品种的特征性状。鸡的胡须是一种在脸颊两侧以及颔下着生的延长生长的羽毛类型。在我国地方鸡种中，惠阳胡须鸡、北京油鸡、丝羽乌骨鸡等均具有胡须性状。惠阳胡须鸡为我国地方优良肉用型品种，又被称为三黄胡须鸡、惠州鸡、龙门鸡、龙岗鸡等，额下呈发达而张开的胡须状房羽(国家畜禽遗传资源委员会组编.中国畜禽遗传资源志地方品种图册.北京：中国农业出版社，2015.2)。惠阳胡须鸡体质结实，胸肌发达，以肉嫩骨细，皮脆味鲜与三黄胡须的外貌驰名中外。鸡的胡须性状同鸡的玫瑰冠、豆冠、复冠、丝羽、缕头、翻毛以及裸颈等性状一样，都可直接在外部表型鉴来定品种和用于育种工作。胡须性状的研究开始于上个世纪初，研究人员通过杂交实验确定胡须是一种常染色体不完全显性遗传的性状(Davenport,C.B.1906.Inheritanceinpoultry.Washington,DC:CarnegieInstitutionPublication,1906；Serebrovsky,A.S.,Petrov,S.G.1930.Onthecompositionoftheplanofthechromosomesofthedomesticshen.J.Exp.Biol.Russia6:157-179.)。然而鸡胡须性状在基因组上的准确定位和解析最近才报道(Guo,Y.,etal.,AComplexStructuralVariationonChromosome27LeadstotheEctopicExpressionofHOXB8andtheMuffsandBeardPhenotypeinChickens.PLoSGenet,2016.12(6):p.e1006071；郭影.鸡胡须性状的基因定位及功能研究,2016,中国农业大学博士学位论文)。该研究采用全基因组关联分析(Genome-wideassociationstudy,GWAS)、连锁分析(Linkageanalysis)、同源一致性(Identitybydescent,IBD)分析、比较基因组杂交芯片(Arraycomparativegenomichybridization,arrayCGH)、全基因组重测序和表达分析等技术手段来研究引起胡须性状的致因基因。研究结果表明胡须性状是由27号染色体上复杂结构变异(Structuralvariation,SV)导致，此结构变异由位于27号染色体上1.7Mb、3.5Mb以及4.4Mb位置的3个拷贝数变异(Copynumbervariation,CNV)组成。3个CNV以CNV3、CNV2和CNV1的顺序串联在一起，并插入CNV1的下游(图1)。该结果在其他鸡胡须鸡群体中(包括北京油鸡，扬州胡须鸡，波兰矮脚鸡，DutchOwl等)验证与胡须性状完全关联。此复杂结构变异区间内共包含七个注释基因，对七个基因在胡须发育的不同阶段基因的表达情况进行检测，结果表明HOXBB基因在下颌皮肤組织中连续的异位高表达，强烈表明其在胡须性状发育过程中具有重要作用。由于鸡胡须性状是由常染色体上一个显性遗传基因控制的，从表型上无法区分纯合型胡须基因个体(Mb/Mb)和杂合性胡须基因个体(Mb/mb)，只能通过测交的方式判定，为胡须性状的选择带来不便。鸡胡须基因(Mb)的定位与鉴定为鸡胡须这一性状的研究和生产应用提供了基础条件。Guo等(2016)报道了一个鉴定胡须基因型的方法，是利用胡须基因复杂结构中重复的CNV1中出现了一个碱基突变(C→T)，建立了一种基于焦磷酸测序的基因分型方法。然而该方法实验过程较多，且需要昂贵的焦磷酸测序仪，在实际应用中不易推广应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鸡胡须性状的基因型快速鉴定方法。本专利技术根据鸡胡须基因在基因组上存在CNV的拷贝数位置变化，用常规PCR、电泳技术和PCR产物条带亮度识别直接鉴定基因型，开发了一种简单、快速、准确鉴定鸡胡须基因的分型方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术基于胡须基因结构中3个拷贝数变异(CNV1、CNV2和CNV3)在基因组上位置与非胡须鸡不同，提供用于鉴别鸡胡须性状基因型的PCR引物组合，包括：正向引物F1：5'-TGGTTGTGTGCCAAGTAGAG-3'(SEQIDNO.1)；正向引物F2：5'-GCTCTTGCTCTTTTTGGTAA-3'(SEQIDNO.2)；以及反向引物R：5'-CTTTTCGTACTGCGTTGTTA-3'(SEQIDNO.3)。本专利技术还提供含有上述引物组合的用于鉴别鸡胡须性状基因型的试剂盒。本专利技术还提供鸡胡须性状的基因型快速鉴定方法，包括以下步骤：1)提取待测鸡的基因组DNA；2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用上述引物组合，进行PCR扩增反应；3)分析PCR产物。利用电泳技术对PCR产物进行电泳；然后用ImageJ软件分析电泳胶图，计算每个泳道中条带的亮度及其比值，从而判定待测鸡的基因型。其中，所述正向引物F1与所述反向引物R组成一对引物，扩增胡须基因207bp序列；所述正向引物F2与所述反向引物R组成一对引物，扩增非胡须基因296bp序列。PCR反应体系以20μl计为：PCR反应条件为：95℃5分钟；95℃30秒，53℃30秒，72℃20秒，共27个循环；72℃7分钟。步骤3)分析PCR产物的方法如下：将PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染色，凝胶成像系统中观察PCR扩增条带，并拍照。用ImageJ软件分析电泳胶图，计算每个泳道中296bp条带和207bp条带的亮度值，并计算207bp条带亮度值与296bp条带亮度值的比值P；P值在0.7-0.9之间判定为胡须鸡基因纯合子，P值在0.2-0.5之间判定为胡须鸡杂合子；P值为0，只扩增出296bp条带，则判定为非胡须鸡个体。本专利技术所述胡须鸡包括惠阳胡须鸡、北京油鸡、丝羽乌骨鸡等。非胡须鸡包括白来航鸡等。本专利技术还提供与鸡胡须性状相关的特异性分子标记，所述分子标记是位于鸡27号染色体上CNV1下游(新增的CNV3与CNV2结合处，图2)，大小为207bp的DNA片段，用于扩增所述分子标记的引物如SEQIDNO.1和3所示。对207bp大小的扩增产物进行测序，通过DNAMAN软件比对，确认其与CNV3与CNV2结合处的碱基序列一致(图3)。本专利技术还提供所述特异性分子标记在鉴定胡须鸡品种中的应用。本专利技术进一步提供所述特异性分子标记在鸡分子标记辅助育种中的应用。本专利技术提供了一种鸡胡须基因的基因型分子鉴定方法及应用，即采用聚合酶链式反应(PCR)和电泳技术来检测具有鸡胡须基因的纯合型、杂合型以及非胡须鸡，根据PCR产物胶图的条带数以及条带亮度进行鸡胡须性状基因型的快速鉴定，可加快选育具有胡须特征鸡种的育种进程，缩短胡须鸡育种时间。附图说明图1为Readdepth分析确定胡须鸡27号染色体存在的CNV及其重排方式。图2为本专利技术实施例2中鸡胡须基因分型引物扩增位置。图3为本专利技术鸡胡须基因207bp大小的扩增产物测序峰图及所在位置。图4本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴别鸡胡须性状基因型的PCR引物组合，其特征在于，包括：正向引物F1：5'‑TGGTTGTGTGCCAAGTAGAG‑3'；正向引物F2：5'‑GCTCTTGCTCTTTTTGGTAA‑3'；以及反向引物R：5'‑CTTTTCGTACTGCGTTGTTA‑3'。

【技术特征摘要】
1.用于鉴别鸡胡须性状基因型的PCR引物组合，其特征在于，包括：正向引物F1：5'-TGGTTGTGTGCCAAGTAGAG-3'；正向引物F2：5'-GCTCTTGCTCTTTTTGGTAA-3'；以及反向引物R：5'-CTTTTCGTACTGCGTTGTTA-3'。2.含有权利要求1所述引物组合的用于鉴别鸡胡须性状基因型的试剂盒。3.鸡胡须性状的基因型快速鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待测鸡的基因组DNA；2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用权利要求1所述引物组合，进行PCR扩增反应；3)分析PCR产物。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20μl计为：5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：95℃5分钟；95℃30秒，53℃30秒，72℃20秒，共27个循环；72℃7分钟。6.根据权利要求3-5项所述的方法，其特征在于，步骤3)分析PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：张浩，张红亮，郑晓彤，赵萱，吴常信，李俊英，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11