本发明专利技术公开了锌指蛋白33B基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用，该分子标记的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:1；在序列表 SEQ ID NO:1第403位存在G-T的碱基突变，该突变导致PshAI-RFLP多态性的产生，鉴定其特定的突变位点以作为牛超数排卵性能相关基因的多态性检测方法，为牛标记辅助育种提供一种有意义的分子标记。
【技术实现步骤摘要】
锌指蛋白33B基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用
本专利技术公开了锌指蛋白33B基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用，具体涉及牛锌指蛋白33B基因片段的克隆及其在牛超数排卵性状标记辅助选择中用途，属于动物基因工程
技术介绍
锌指蛋白家族是含有通过结合Zn2+稳定的、短的、可以自我折叠形成“手指”结构的一类蛋白质。由于其自身的结构特点,可以选择性的结合特异的靶结构,使锌指蛋白在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育等生命过程中发挥重要作用（KlugA等，Zincfingers:anovelproteinfoldfornucleicacidrecognition.ColdSpringHarborSymposiaonQuantitativeBiology52:473–482）。ElenaLabarta等（ElenaLabarta等，Hormonalandmolecularcharacterizationoffollicularfluid,cumuluscellsandoocytesfrompre-ovulatoryfolliclesinstimulatedandunstimulatedcycles.HumReprod.2012(6):1596-1605）报道，锌指蛋白33B（ZNF33B）作为锌指蛋白家族成员之一，在超数排卵后的人类颗粒细胞中显著的下调表达，表明其在卵母细胞成熟过程中具有潜在作用，而卵母细胞成熟则直接关系到超数排卵的实际效果。因此，ZNF33B基因可以被选定为影响超数排卵性状的候选基因，其单核苷酸遗传多态性可作为动物繁殖和生产性能辅助选择的分子标记。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了锌指蛋白33B基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用，为牛标记辅助育种提供一种有意义的分子标记。本专利技术的技术解决方案如下：本专利技术所述的锌指蛋白33B基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用，其特征在于：该分子标记的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1；在序列表SEQIDNO:1第403位存在G-T的碱基突变，该突变导致PshAI-RFLP多态性的产生。扩增本专利技术所述分子标记的引物一对，其DNA序列如下所示：ZNF33B-F:5’-GGAAGTTAAACAGCCTAGT-3’（正向引物）ZNF33B-R:5’-GGTTCTGTTCTTGATTTGC-3’（反向引物）本专利技术提供的锌指蛋白33B基因作为牛超数排卵性状分子标记的方法，包括以下步骤：通过设计特异性引物一对，正向引物ZNF33B-F:5’-GGAAGTTAAACAGCCTAGT-3’和反向引物ZNF33B-R:5’-GGTTCTGTTCTTGATTTGC-3’，从牛血液中提取基因组DNA，进行PCR扩增，获得ZNF33B基因片段的DNA序列，如表SEQIDNO:1；利用限制性内切酶PshAI检测PCR产物片段的DNA序列第403位的G-T碱基突变，PCR扩增产物经PshAI酶切产生三种基因型，经2%琼脂糖凝胶电泳可明显判别不同带型，将检测结果所示的不同基因型与牛超数排卵性状关联分析，具备特定的基因型的个体将获得更好超数排卵效果。本专利技术对牛ZNF33B基因部分DNA序列的克隆：PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示为特异性PCR产物，如图1所示。将PCR产物回收测序，结果显示产物长度为620bp。测序结果显示该片段403bp处存在T、G两个等位基因，部分测序峰如图3所示。针对牛ZNF33B基因部分DNA片段PCR-RFLP诊断方法的建立：用本专利技术设计的特异性引物扩增牛基因组DNA得到的620bp特异扩增片段。测序的结果发现在该403bp片段存在的突变会导致PshAI酶切位点（GACNN^NNGTC），其中第399bp-400bp处为酶切位点。扩增产物经过限制性内切酶PshAI酶切可产生三种基因型，即TT型、TG型和GG型，具体如图2所示。对标记性状进行关联分析：本专利技术中牛ZNF33B基因的扩增序列PshAI多态位点与牛超数排卵性状的关联分析结果表明，此酶切位点不同基因型所对应的个体的部分超数排卵性状存在显著或极显著的差异。本专利技术的积极效果在于：公开了锌指蛋白33B基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用，该分子标记的核苷酸序列第403位存在G-T的碱基突变，该突变导致PshAI-RFLP多态性的产生，鉴定其特定的突变位点以作为牛超数排卵性能相关基因的多态性检测方法，为牛标记辅助育种提供一种有意义的分子标记。附图说明图1是ZNF33B基因扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，1-15泳道为被检测的15个PCR产物。图2是2%琼脂糖凝胶电泳检测ZNF33B基因扩增产物的PshAI酶切结果。其中M泳道为标准分子量Marker。泳道5为GG型个体；泳道1、2、4、7、8、10、11、12、13为TG型个体；泳道3、6、9、14、15为TT型个体。图3是本专利技术扩增的ZNF33B基因部分DNA序列中突变位置的克隆测序峰图。图4是实施例2中PCR扩增产物的1.5%琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1-16为被检测的PCR产物。图5是实施例2中酶切反应产物的2%琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1-16为被检测的酶切产物。其中1、6、7、14泳道为TT型个体；2、3、5、9、10、11泳道为GG型个体；4、8、12、13、15、16泳道为TG型个体。具体实施方式为了更清楚地理解本专利技术，用具体实施方式详细描述具体内容。实施例1一、牛ZNF33B基因部分DNA片段的克隆利用Oligo6.0软件设计特异性引物1对，为保证良好的引物质量，在本专利技术中，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，扩增产物长度为620bp，引物序列如下所示：ZNF33B-F:5’-GGAAGTTAAACAGCCTAGT-3’(正向引物)ZNF33B-R:5’-GGTTCTGTTCTTGATTTGC-3’(反向引物)PCR反应过程中所需要的Taq酶、Buffer、镁离子、dNTP等可自行选择。为较快地获得良好的结果，本专利技术选择Biomiga公司的2×BenchTopTMTaqMastermix进行PCR扩增。具体反应体系为：2×MasterMix（产品包装盒内提供，其中含TaqDNAPolymerase0.05units/μl,4mMMgCl2,0.4mMdNTPs）10.0μl,正向引物与反向引物（浓度为均为10pmol/μl）各0.5μl,基因组DNA0.5μl(含10-50ngDNA)，二馏水8.5μl。PCR反应条件为：94℃预变性5分钟,94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环，72℃最后延伸5分钟。二、PCR-RFLP方法的建立1、PCR产物的检测本专利技术随机抽取441头母牛进行基因组DNA提取，用本专利技术设计的引物ZNF33B-F和ZNF33B-R进行扩增，得到620bp的特异性扩增产物，经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示为特异性PCR产物,见图1，其中M泳道为标准分子量Marker，1-15泳道为被检测的15个PCR产物。2、针对牛ZNF33B基因部分DNA片段PCR-R本文档来自技高网...
【技术保护点】
锌指蛋白33B基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用，其特征在于：该分子标记的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:1；在序列表 SEQ ID NO:1第403位存在G‑T的碱基突变，该突变导致PshAI‑RFLP多态性的产生。
【技术特征摘要】
1.锌指蛋白33B基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用，其特征在于：该分子标记的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1；在序列表SEQIDNO:1第403位存在G-T的碱基突变，该突变导致PshAI-RFLP多态性的产生。2.一种锌指蛋白33B基因作为牛超数排卵性状分子标记的检测方法，包括以下步骤：通过设计特异性引物一对：正向引物ZNF33B-F:5’-GGAAGTTAAACAGCCTAGT-3’；反向引物ZNF33B-R:5’-GGTTCTGTTCTTGA...
【专利技术属性】
技术研发人员：张嘉保，李树静，李常红，余文莉，姜昊，陈龙，毕江华，冯春涛，陈承祯，袁宝，高妍，
申请(专利权)人：吉林大学，河北天和肉牛养殖有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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