肿瘤循环DNA技术检测‑癌症早期易发风险评估数据法制造技术

一种新的循环DNA检测方法应用于癌症早期患病风险评估，利用循环DNA的特性，制备多孔径网状的纳米颗粒对血浆中肿瘤细胞释放到血浆中的游离小片段DNA进行富集及提取，多孔径网状纳米颗粒的设计使得富集ctDNA的面积明显增加，富集效率更高，不同大小的孔径设计只能针对100~300bp的游离小片段进行富集，这些游离小片段可以顺利通过纳米颗粒上孔径，并停留在纳米颗粒内部，经过一定转速的离心使得游离小片段DNA与纳米颗粒一起富集到离心管底部。具体优点如下：缩短ctDNA提取及富集时间，降低成本，以CT值为Y轴，DNA质量为X轴绘制计算曲线并得到计算公式。确定正常健康人群肿瘤易感基因在血浆中的拷贝数范围。根据正常参考范围评估癌症患病风险。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于临床辅助检测应用型专利，尤其涉及血浆中循环DNA的提取及癌症早期患病风险评估检测方法的建立，具体为一种癌症早期患病风险评估的快速检测方法。
技术介绍
ctDNA(circulatingtumorDNA)，简称循环肿瘤DNA，是指肿瘤细胞中的DNA释放到血液循环系统中的100-300bp的片段。血液中游离小片段DNA早在1947年由Mandel和Metais发现，但由于缺乏灵敏性和特异性的试验方法，导致相关性研究进展缓慢，直至提取游离小片段DNA的技术出现，并结合荧光定量PCR技术在检测技术中的应用，将为临床肿瘤的早期诊断，治疗方案的确定，疗效观察，预后评估，转移风险分析；复发监测等方面提供巨大的临床参考价值。Sozzi等人发现在Ⅰ期的肺癌患者中循环肿瘤DNA已经存在于血液中以及相关的DNA微卫星也发生改变；Sozzi针对38例已经进行肺癌手术的患者追踪调查发现，无复发患者有35人，在术后的6个月中血液中的肿瘤循环DNA的含量显著低于术前的平均水平，但是术后ctDNA明显成倍增长的3人中，有2人术后2个月死于肝转移，另一例则在第二年后复发，这说明肿瘤循环DNA与肿瘤病情检测密切相关。MulcahyHE等人为患有胰腺癌的患者进行检测发现血浆中DNAK-ras发生了突变，突变率高达80％以上，其中有4例为胰腺炎的患者在血清中发现K-ras突变，在之后的一年里被诊断为胰腺癌。说明ctDNA具有肿瘤早期诊断能力，因此也进一步说明，对于正在接受肿瘤治疗的患者如果肿瘤循环DNA持续升高，则治疗方案应重新拟定，而持续下降的患者则说明仍处于缓解期。ctDNA作为肿瘤的标志物，在肿瘤诊断、治疗、预后检测方面发挥重要作用。血浆中的ctDNA突变与肿瘤患者的组织特异性相一致性，使良性细胞异常增殖，细胞凋亡增加，进而导致血液中ctDNA也随之增加，通过对ctDNA更准确的定性和定量，可以更好的应用于临床。但是目前没有一种很好的方法去实现癌症早期风险评估。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术提供一种利用肿瘤循环DNA检测进行癌症早期风险评估的方法，其目的是解决以往所存在的问题。技术方案：一种新的循环DNA检测方法应用于癌症早期患病风险评估，其特征在于：利用循环DNA的特性，制备多孔径网状的纳米颗粒对血浆中肿瘤细胞释放到血浆中的游离小片段DNA进行富集及提取，多孔径网状纳米颗粒的设计使得富集ctDNA的面积明显增加，富集效率更高，不同大小的孔径设计只能针对100～300bp的游离小片段进行富集，这些游离小片段可以顺利通过纳米颗粒上孔径，并停留在纳米颗粒内部，经过一定转速的离心使得游离小片段DNA与纳米颗粒一起富集到离心管底部。而未经消解的片段较大的游离DNA则不能通过纳米颗粒上的孔径进而排除在外，随着离心及其他试剂的作用下被剔除掉。以已知质量的肿瘤组织基因组DNA为模板，进行不同梯度稀释，利用具有肿瘤特异性的基因及其热点突变设计分子探针进行QPCR检测。以基因组DNA的质量为X轴，QPCR检测得到的CT值为Y轴绘制计算曲线，得到计算公式及标准曲线。利用得到的计算公式及标准曲线，我们收集了50例健康人群样本，利用本专利中的血浆中游离小片段DNA提取试剂盒对血浆中ctDNA进行富集提取，以提取的ctDNA为模板并利用具有肿瘤特异性的基因及其热点突变设计分子探针进行QPCR检测，得到QPCR检测的最低CT值及最高CT值，分别带入到绘制标准曲线时得到的计算公式中，计算得到X值，10x即为QPCR模板上样量体积中所含的该基因拷贝数，利用新公式(10x×a)/2b计算出每毫升血浆中该基因拷贝数(其中a为ctDNA总体积；b为QPCR上样模板体积)进而计算出血浆中所含的该基因拷贝数的最高值及最低值。未知样本利用本检测方法进行检测后，可根据得到的基因拷贝数所在的区间，对肿瘤易感性的高低进行判定。在排除患者年龄、个人作息习惯及近期炎症反应等干扰因素，评估该基因拷贝数值是否出现异常。规定检测范围为正常，肿瘤易感性较低，建议每6个月进行一次复检；检测范围为偏高值，肿瘤易感性较高，建议每3个月进行一次复检；检测范围为高值，肿瘤易感性明显高于健康人群，建议每2周进行一次复检，若复检结果持续高值则进入肿瘤高发期，应增加医院影像学检测的频率，在肿瘤早期发现并着手治疗。一种肿瘤循环DNA定性和定量形成癌症早期易发风险评估数据法，其特征在于：包括以下步骤：人体血浆制备及循环DNA提取、循环DNA提取试剂盒灵敏度检测、循环DNA检测方法建立,确定检测方法、检测结果计算及确定检测范围；本方法主要利用循环DNA的特性，制备多孔径网状的纳米颗粒对血浆中肿瘤细胞释放到血浆中的游离小片段DNA进行富集及提取，以肿瘤组织基因组DNA为模板，进行不同梯度稀释，利用具有肿瘤特异性的基因及其热点突变设计分子探针进行QPCR检测，以基因组DNA的质量为X轴，QPCR检测得到的CT值为Y轴绘制计算曲线，得到计算公式。该方法的步骤如下：(1)确定肿瘤易感基因检测计算方法及正常参考区间：(a)、模板制备：癌症组织基因组DNA样本，利用Nanodrop可测量DNA浓度或质量的核酸分析仪进行测量，根据DNA浓度不同，将DNA分别稀释不同梯度，以稀释后的DNA为模板进行QPCR检测；检测结果中以CT值为Y轴，以模板DNA的质量为X轴绘制作图曲线并得到y＝kx+b型计算公式及R2值；(b)、引物设计：在NCBI或其他数据库及文献中获得肿瘤易感基因突变频率较高的位点，将该基因的基因序列从NCBI中拷贝出来，选取其中一个热点突变，将原基因序列稍作改变成基因突变后的序列，利用如DNAMAN、Oligo、Primer5等引物设计软件，进行分子探针设计，分子探针设计原则为：上游正向引物的最后一位碱基与突变后位点碱基一致，或下游反向引物的反向互补序列的最后一位碱基与突变后位点碱基一致；扩增片段大小介于90～120bp之间；(c)、QPCR检测：利用任意SYBRGreenQPCR检测试剂盒说明进行操作；(d)、正常参考区间确定：收集正常非肿瘤患者50例，分别提取ctDNA，并利用以上方法进行QPCR检测，检测结果得到的CT值作为Y值带入到模板制备获得的计算公式y＝kx+b中，得出X值，10x即为模板上样量2ulctDNA中所含的该基因拷贝数，利用新公式(10x×a)/2b计算出每毫升血浆中该基因拷贝数(其中a为ctDNA总体积；b为QPCR上样模板体积)。通过50例健康人群的检测，得到QPCR检测肿瘤易感基因拷贝数的最高值及最低值，在针对未知样本进行检测时，基因拷贝数落在最高值和最低值之间的个体，即为正常水平检测范围，对肿瘤的易感性相对较低。正常参考区间确定之后进行检测结果说明：检测结果共分低、偏高、高三个区间；检测结果显示基因拷贝数值低，则对肿瘤易感性低，该类人群每半年进行一次复检；检测结果显示基因拷贝数偏高，则对肿瘤易感性较高，该类人群建议每3个月进行一次复检；检测结果显示基因拷贝数接近或已经高出正常范围，则属于肿瘤易感高危人群，该类人群建议每2周进行一次复检。排除患者年龄、个人作息习惯及近期炎症反应等干扰因素，评估该基因拷贝数值是否出现异常；规定检测范围为正常，肿瘤易感性较低，建议每6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤循环DNA技术检测‑癌症早期易发风险评估数据法，其特征在于：包括以下步骤：人体血浆制备及循环DNA提取、循环DNA提取试剂盒灵敏度检测、循环DNA检测方法建立,确定检测方法、检测结果计算及确定检测范围；本方法主要利用循环DNA的特性，制备多孔径网状的纳米颗粒对血浆中肿瘤细胞释放到血浆中的游离小片段DNA进行富集及提取，以肿瘤组织基因组DNA为模板，进行不同梯度稀释，利用具有肿瘤特异性的基因及其热点突变设计分子探针进行QPCR检测，以基因组DNA的质量为X轴，QPCR检测得到的CT值为Y轴绘制计算曲线，得到计算公式。

【技术特征摘要】
2016.05.17 CN 20161032755561.一种肿瘤循环DNA技术检测-癌症早期易发风险评估数据法，其特征在于：包括以下步骤：人体血浆制备及循环DNA提取、循环DNA提取试剂盒灵敏度检测、循环DNA检测方法建立,确定检测方法、检测结果计算及确定检测范围；本方法主要利用循环DNA的特性，制备多孔径网状的纳米颗粒对血浆中肿瘤细胞释放到血浆中的游离小片段DNA进行富集及提取，以肿瘤组织基因组DNA为模板，进行不同梯度稀释，利用具有肿瘤特异性的基因及其热点突变设计分子探针进行QPCR检测，以基因组DNA的质量为X轴，QPCR检测得到的CT值为Y轴绘制计算曲线，得到计算公式。2.根据权利要求1所述的肿瘤循环DNA技术检测-癌症早期易发风险评估数据法，其特征在于：该方法的步骤如下：(1)确定肿瘤易感基因检测计算方法及正常参考区间：(a)、模板制备：癌症组织基因组DNA样本，利用Nanodrop可测量DNA浓度或质量的核酸分析仪进行测量，根据DNA浓度不同，将DNA分别稀释不同梯度，以稀释后的DNA为模板进行QPCR检测；检测结果中以CT值为Y轴，以模板DNA的质量为X轴绘制作图曲线并得到y＝kx+b型计算公式及R2值；(b)、引物设计：在NCBI或其他数据库及文献中获得肿瘤易感基因突变频率较高的位点，将该基因的基因序列从NCBI中拷贝出来，选取其中一个热点突变，将原基因序列稍作改变成基因突变后的序列，利用引物设计软件，进行分子探针设计，分子探针设计原则为：上游正向引物的最后一位碱基与突变后位点碱基一致，或下游反向引物的反向互补序列的最后一位碱基与突变后位点碱基一致；扩增片段大小介于90～120bp之间；(c)、QPCR检测：利用任意SYBRGreenQPCR检测试剂盒说明进行操作；(d)、正常参考区间确定：收集正常非肿瘤患者50例，分别提取ctDNA，并利用以上方法进行QPCR检测，检测结果得到的CT值作为Y值带入到模板制备获得的计算公式y＝kx+b中，得出X值，10x即为模板上样量2ulctDNA中所含的该基因拷贝数，利用新公式(10x×a)/2b计算出每毫升血浆中该基因拷贝数，其中a为ctDNA总体积；b为QPCR上样模板体积；通过50例健康人群的检测，得到QPCR检测肿瘤易感基因拷贝数的最高值及最低值，在针对未知样本进行检测时，基因拷贝数落在最高值和最低值之间的个体，即为正常水平检测范围，对肿瘤的易感性相对较低。3.根据权利要求2所述的肿瘤循环DNA技术检测-癌症早期易发风险评估数据法，其特征在于：正常参考区间确定之后进行检测结果说明：检测结果共分低、偏高、高三个区间；检测结果显示基因拷贝数值低，则对肿瘤易感性低，该类人群每半年进行一次复检；检测结果显示基因拷贝数偏高，则对肿瘤易感性较高，该类人群建议每3个月进行一次复检；检测结果显示基因拷贝数接近或已经高出正常范围，则属于肿瘤易感高危人群，该类人群建议每2周进行一次复检。4.根据权利要求4所述的肿瘤循环DNA技术检测-癌症早期易发风险评估数据法，其特征在于：排除患者年龄、个人作息习惯及近期炎症反应等干扰因素，评估该基因拷贝数值是否出现异常；规定检测范围为正常，肿瘤易感性较低，建议每6个月进行一次复检；检测范围为偏高值，肿瘤易感性较高，建议每3个月进行一次复检；检测范围为高值，肿瘤易感性明显高与健康人群，建议每半个月进行一次复检，若复检结果持续高值则进入肿瘤高发期，应增加医院影像学检测的频率，在肿瘤早期发现并着手治疗。5.根据权利要求2所述的肿瘤循环DNA技术检测-癌症早期易发风险评估数据法，其特征在于：(1)步骤模板制备中：绘制计算曲线并得到计算公式，绘制的计算曲线中应涵盖正常CT值...

【专利技术属性】
技术研发人员：程澎，贾世哲，
申请(专利权)人：程澎，贾世哲，
类型：发明
国别省市：辽宁;21