本发明专利技术提供癌症发病或癌症发病风险的高精度、且定量的判定方法，所述判定方法通过在生物体组织中进行定量组织染色法来进行，所述组织染色法中使用了诸如抑制癌细胞的运动性及浸润性的PAR1抗体等识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体。本发明专利技术使用下述组织染色方法，判定癌症发病或癌症发病风险，所述组织染色方法包括如下工序：用荧光物质标记识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体、使该经荧光标记的抗体与组织试样接触的工序；向所述抗体接触的组织部位照射激发光、获得荧光图像的工序；获得在与所述荧光图像为相同视野及相同焦点时的、与所述荧光物质发出的荧光波长的获得区域相比为短波长侧或长波长侧的附近区域的自身荧光图像的工序；进行图像处理、从所述荧光图像的荧光亮度除去所述自身荧光图像的荧光亮度、获得校正荧光图像的工序；对抗体接触的组织部位的细胞数进行计数的工序；计算测量1粒子的荧光粒子的平均荧光亮度的工序；算出每1个细胞的荧光粒子数的工序。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及，所述判定方法使用了有效排除自身荧光导致的影响、能以高精度定量地进行分析的组织染色法。
技术介绍
癌症与心肌梗塞、脑梗塞代表的血管系统疾病一起，是成年人死亡原因两大类疾病。例如，虽然日本人的乳癌罹患率比欧美诸国低，但近年来有增加的倾向，1998年超过胃癌的罹患率，成为女性罹患率的第I位。根据作为最近的报告的2005年日本厚生劳动省统计，乳癌的年罹患数超过5万人。关于癌症的诊断，除了 X射线CT、MRI等图像诊断之外，检测对特定的癌症来说特异性表达的癌症标志物、血液、组织中渗出的癌症标志物等的方法也是常用的。作为乳癌的一般性筛查检查，实施问诊、触诊、乳房X射线照相术(乳房造影术(mammography))、超声波检查等，如果产生临床怀疑，则实施细胞诊断、活组织检查，通过病理学诊断判别是否是癌症。为了判定癌症治疗、预后的发展，病理学诊断很重要，成为这种诊断的中心的是“为进行形态观察的HE染色法”和“使用针对癌症标志物因子的抗体的免疫组织化学法”。特别地，由于近年来抗体药物的登场，免疫组织化学的重要性急剧增高。例如，作为抗体药物代表的赫赛汀(HER2抗体:针对人上皮生长因子受体2的抗体)(注册商标)是乳癌代表性的抗癌剂，作为给予该药剂的判定基准，临床上进行使用HER2抗体的免疫组织化学法。但是，迄今为止通过免疫组织化学法的方法均使用DAB为代表的酶法、通过病理医师的目视诊断来进行。因此，检测灵敏度低，还存在定量上的问题。近年来，代替通过DAB的酶法，作为检测灵敏度.定量性优秀的检测方法，量子点等荧光性粒子受到关注。对量子点而言，因为粒子数与荧光亮度呈比例关系，因此通过在免疫组织化学法中使用使量子点与癌症标志物的抗体结合的探针，有可能能高精度、定量地分析癌症标志物的表达量。作为癌症最具威胁的一点，可以举出转移。已知PARl (蛋白酶活化受体I)是活化癌细胞移动能力及浸润能力的膜蛋白质，其与多种癌症(乳癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌等)的转移相关。特别地，人们认为，对乳癌而言，具有转移能力的癌培养细胞株几乎都表达PAR1,通过基质金属蛋白酶I (MMP1:Matrix Metalloprotease I)切断PARl的N末端的细胞外区域时，PARl活化，细胞移动能力及浸润能力得到增强(例如参见非专利文献I)。本专利技术人等报道了如下内容:制作抑制由MMPl导致的对PARl的切断，从而抑制癌细胞的移动性及浸润能力的PARl抗体，该抗体抑制由MMPl诱导的细胞运动活性及细胞浸润活性(例如参见专利文献I)。专利文献I国际公开第09/119455号说明书非专利文献I Boire A, Covic L, Agarwal A, Jacques S, Sheriff S, KuliopulosA.PARl is a matrix metalloprotease-1 receptor that promotes invasion andtumorigenesis of breast cancer cells.Cell 120:303-313(2005)
技术实现思路
虽然量子点等荧光粒子因为能发挥自身具有的稳定性和定量分析的威力、人们对其作为荧光免疫染色中的新途径期望较高，但作为定量分析却仅限于培养细胞。作为其理由，很大的原因在于，培养细胞由于细胞自身荧光较弱，量子点荧光粒子的荧光亮度能以足够高的S(信号)/N(噪声)比形式算出，与之相对，生物体组织由于具有与培养细胞相比为非常强的自身荧光，因此量子点荧光粒子的荧光亮度不能以足够高的S/N比算出。虽然生物体组织的长波长的自身荧光比短波长的自身荧光量少，但是也不能忽视在观察中的影响，难于进行生物体组织中量子点荧光粒子的定量分析。本专利技术的课题是，提供通过生物体组织中定量的组织染色法而进行的高精度且定量的，所述组织染色法使用了抑制癌细胞的运动性及浸润性的PARl抗体等识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体。作为除去生物体组织染色法中自身荧光的影响的方法，已知有(a)通过激发光照射的自身荧光褪色法、(b)对比度调整法等(参见图2)。关于上述(a)通过激发光照射的自身荧光褪色法，其利用量子点荧光粒子具有的光稳定性，通过长时间光照射，能够使得来源于量子点荧光粒子的亮度不褪色而仅使自身荧光褪色，但完全褪色需要长时间，另外仅照射面的自身荧光能褪色也是缺点。另外，关于上述(b)对比度调整法，在量子点荧光粒子的荧光强度比自身荧光的强度弱的情况下，通过消除自身荧光图像的对比度调整，量子点荧光粒子的荧光亮度也消失了，并且，还存在自身荧光根据试样的种类、场所大为不同因此无法确定一定的阈值的缺点。本专利技术的专利技术人对代替上述(a)或(b)方法的除去自身荧光的影响方法进行了深入研究，发现:用波长为488nm的激发光照射用经量子点荧光粒子(Qdot705)标记的PARl抗体(PARlab_QD705)免疫染色的乳癌组织试样，通过荧光波长的获得区域为695 740nm的带通滤波器获得量子点荧光粒子的荧光图像(量子点荧光粒子的荧光+自身荧光)，之后通过荧光波长的获得区域为640 690nm的带通滤波器获得与上述荧光图像为完全相同焦平面及完全相同视野中的仅自身荧光的自身荧光图像，通过从荧光静止图像的各像素的荧光亮度减去自身荧光图像中相应的各像素的荧光亮度，能获得从荧光静止图像减去了自身荧光图像(自身荧光)的仅量子点荧光粒子的荧光的图像(校正荧光图像)。另外，为了确定上述校正荧光图像中含有的量子点荧光粒子的粒子数，利用了量子点特有的“闪烁(明灭)性”。即，确认了:对I粒子的量子点荧光粒子来说，因为在20秒的激发光照射时间中关闭状态(off-state，灭失状态)呈约4秒，所以算出具有约4秒的关闭状态(灭失状态)的粒子的平均亮度作为I粒子的量子点荧光粒子的荧光亮度，然后即可算出校正荧光图像中每I个细胞的量子点的荧光粒子的粒子数。进一步地，使用未复发存活乳癌患者组织、复发患者乳癌组织、癌患者的正常乳腺组织，算出以PARlab-QD705检测的量子点荧光粒子数，结果发现，较之癌患者的正常乳腺组织，未复发存活乳癌患者组织、复发患者乳癌组织中，以PARlab-QD705检测的量子点荧光粒子数显著更多。本专利技术基于上述发现而完成。S卩，本专利技术涉及:(I)，其特征在于使用包括下述工序(a) (d)的组织染色方法，工序(a)，用荧光物质标记识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体，使该经荧光标记的抗体与组织试样接触；工序(b)，向所述抗体接触的组织部位照射激发光，获得荧光图像；工序(C)，获得在与所述荧光图像为相同视野及相同焦点时的、与所述荧光物质发出的荧光波长的获得区域相比为短波长侧或长波长侧的附近区域的自身荧光图像；工序(d)，进行图像处理，从所述荧光图像的荧光亮度除去所述自身荧光图像的荧光亮度，获得校正荧光图像。(2)上述I所述的判定方法，特征在于癌症的增殖控制因子或转移控制因子是PARl (蛋白酶活化受体I)。(3)上述(I)或(2)所述的判定方法，特征在于，癌症为乳癌。(4)上述(I) (3)中任一项所述的判定方法，特征在于，荧光物质发出的荧光波长的获得区域与其附近区域的波长之差在IOOnm以内。(5)上述(本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.02 JP 2010-1964421.一种癌症发病或癌症发病风险的判定方法，其特征在于，使用包括下述工序(a) (d)的组织染色方法， 工序(a)，用荧光物质标记识别癌症的增殖控制因子或转移控制因子的抗体，使该经荧光标记的抗体与组织试样接触； 工序(b)，向所述抗体接触的组织部位照射激发光，获得荧光图像； 工序(C)，获得在与所述荧光图像为相同视野及相同焦点时的、与所述荧光物质发出的荧光波长的获得区域相比为短波长侧或长波长侧的附近区域的自身荧光图像； 工序(d)，进行图像处理，从所述荧光图像的荧光亮度除去所述自身荧光图像的荧光亮度，获得校正荧光图像。2.如权利要求1所述的判定方法，其特征在于，癌症的增殖控制因子或转移控制因子是PARl，所述PARl是蛋白酶活化受体I。3.如权利要求1或2所述的判定方法，其特征在于，癌症为乳癌。4.如权利要求1 3中任一项所述的判定方法，其特征在于，荧光物质发出的荧光波长的获得区域与其附近区域的波长之差在IOOnm以内。5.如权利要求1 4中任一项所述的判定方法，其特征在于，荧光物质发出的荧光波长的获得区域为近红外区域。6.如权利要求1 5中任一项所述的判定方法,其特征在于,激发光的波长为400 700nm。7.如权利要求1 6中任一项所述的判定方法,其特征在于,突光物质为突光粒子。8.如权利要求7所述的判...
【专利技术属性】
技术研发人员：权田幸祐，宫下穰，武田元博，大内宪明，
申请(专利权)人：国立大学法人东北大学，
类型：
国别省市：
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