利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法技术

一种新的利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，利用特定的游离小片段DNA提取试剂盒对癌症患者血浆中的肿瘤DNA片段进行分离提取。以得到的肿瘤DNA片段为模板，设计肿瘤易感基因个性化分子探针对基因拷贝数进行QPCR检测，肿瘤患者检测周期为2周至1个月不等，根据患者化疗周期而定。该检测方法作为一种方便、非侵入性、可重复性和高敏感性的“液体活检”技术，可应用于各种肿瘤易感基因及癌症，是一种先于临床肿瘤标志物检测的重要癌症治疗效果、耐药性及复发风险评估手段。

Method for monitoring the number of tumor cells in cancer patients using circulating DNA

A new method for monitoring the number of tumor cells in patients with cancer by using cyclic DNA was developed, which was used to separate and extract the tumor DNA fragments from the plasma of cancer patients by using a specific free small fragment DNA extraction kit. In order to get the tumor DNA fragment as template, the design of tumor susceptibility gene for personalized molecular probe gene copy number was detected by QPCR, the detection cycle tumor patients ranged from 2 weeks to 1 months, according to the patients during chemotherapy and. The detection method as a convenient, non-invasive, reproducible and sensitive Gao Min \liquid biopsy\ techniques can be applied to a variety of tumor susceptibility gene and cancer, is a kind of important tumor markers precede clinical cancer treatment, detection of drug resistance and recurrence risk assessment method.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于临床辅助检测应用型技术，尤其涉及利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法。
技术介绍
循环肿瘤DNA(circulatingtumor，ctDNA)是一类来源于肿瘤细胞的DNA片段，大小在100-300bp之间，是由机体细胞释放到外周血循环后发生部分降解的内源性DNA。早在1947年Mandcl和Metals就发现了血液中游离的小片段DNA，1977年Leon等人研究发现肿瘤患者血液循环中游离DNA水平显著高于正常人。Domirguez等对膀胱癌患者血浆DNA和肿瘤组织DNA分别进行检测，结果发现在27例膀胱癌患者中有17例患者这两者变化十分相似，Szymanska等人对29例肝癌患者进行血浆DNA与肿瘤DNA检测时发现，两者变异一致性高达88.5％。此外，大量研究表明，外周血循环DNA信息与肿瘤细胞基因组信息具有一致性，因此对外周血循环肿瘤DNA进行定量分析将为临床肿瘤的早期诊断、治疗方案的确定、疗效观察、预后评估、转移风险分析、复发监测等方面提供巨大的临床参考价值。近年来，有关循环肿瘤DNA水平变化与抗肿瘤疗效预测方面的研究显著增多。MuLcahy等人对21例胰腺癌患者的循环肿瘤DNA进行检测，发现17例患者K-ras基因发生突变,其中有4例该基因突变患者最初被诊断为胰腺炎,之后一年陆续发展为胰腺癌。Banki等人对食管癌术后患者进行跟踪随访时发现，术后循环肿瘤DNA水平降至正常的患者，在中位生存期复查时病情稳定，无明显复发、转移征象，而术后循环肿瘤DNA水平上升的患者则出现了疾病的复发。国内也有系统性研究发现，肺癌、结肠癌等发生复发转移时循环肿瘤DNA的含量明显增高。而Peeters等人发现在原发性结直肠癌患者血浆中通常不存在61号密码子突变的N-ras和K-rasDNA片段，但在使用EGFR阻滞剂治疗并产生抗性后，约有46％患者体内可检测到两种突变基因表达量显著升高。这些变化的数据可以作为中间数据，以辅助诊断。但是目前的对这些中间数据的检测方法及效果均不理想。
技术实现思路
：专利技术目的：本专利技术提供一种新的利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，其目的是解决以往所存在的问题，其通过对肿瘤易感基因在ctDNA中的拷贝数检测，利用基因拷贝数检测结果绘制动态曲线以作为中间参考数据。技术方案：一种新的利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，其特征在于：利用特定的游离小片段DNA提取试剂盒对癌症患者血浆中的肿瘤DNA片段进行分离提取。以得到的肿瘤DNA片段为模板，设计肿瘤易感基因个性化分子探针对基因拷贝数进行QPCR检测，肿瘤患者检测周期为2周至1个月不等，根据患者化疗周期而定。绘制动态曲线，观察易感基因拷贝数变化是否出现升高或下降趋势，进而提示患者体内癌症细胞总数变化。包括以下步骤：人体血浆制备及循环DNA提取、肿瘤循环DNA提取、设计肿瘤易感基因个性化分子探针、QPCR检测、绘制动态曲线并提示肿瘤患者治疗效果、耐药性及对复发风险进行评估。已经罹患癌症的患者中，建议术前及术后两周分别对易感基因拷贝数进行检测，之后每半个月或1个月复查一次，并根据医生建议开始化疗。在对该基因进行检测的同时，绘制基因拷贝数变化曲线。若该基因拷贝数与术前相比有下降趋势，建议继续保持现有的治疗方法，并继续跟踪该基因拷贝数变化。若该基因拷贝数与术前或与相近几次检测结果相比并无明显差异，且2到3次检测结果相似，则说明癌细胞没有得到明显抑制或应更换治疗方案。若该基因拷贝数与术前或相近几次检测结果相比有上升趋势，说明患者已经对该治疗方案产生免疫或化疗药物对患者产生毒害性，建议及时更换治疗措施并继续跟踪该基因拷贝数变化。利用肿瘤易感基因拷贝数的变化，基因拷贝数降低则意味着现有治疗方法可行有效；基因拷贝数升高则意味着对现有药物产生耐药性或现有的治疗方案无效，复查后拷贝数仍持续升高则建议应该更换治疗方案。检测结果如果始终维持在同一水平，则意味着暂无复发风险，病情较为稳定；若检测结果与前一次或前几次检测结果相比有上升趋势或持续上升，则意味着复发风险较高或已经复发。本专利属于临床辅助检测应用型专利，本专利涉及的检测方法主要提供一种高效、准确的循环DNA肿瘤易感基因检测手段，主要应用于癌症患者治疗、耐药性及复发风险的评估，其只是一种中间数据的检测，并不能作为最终诊断结果。本专利涉及到的检测手段及理念归本公司所有，以该检测手段及理念衍生出的其他检测方法均在本专利权利保护范围内。该方法的步骤如下：(一)血浆中ctDNA提取EDTA抗凝管中抽取5ml静脉血；上下颠倒混匀，4℃运输；静脉血放入离心机，1600g，4℃，离心10min；吸取上清液至新的无菌2.0ml离心管中；16000g，4℃，离心10min；吸上清至新的无菌2.0ml离心管中；向2mlEP管中加入1ml血浆样本，再加入1mllysisbuffer，30μl蛋白酶K和60μl纳米颗粒吸附磁珠。充分颠倒混匀5min。将混匀样品放入离心机，12000rpm，常温离心3min，吸弃上清(如向获取更多的ctDNA，则重复步骤1、2)；向含有沉淀的管中加入1mlwashbufferI，用移液枪反复吹打，将沉淀充分悬浮均匀。放入离心机，常温离心，13000rpm，1min。吸弃上清。向含有沉淀的管中加入1mlwashbufferII，用移液枪反复吹打，将沉淀充分悬浮均匀。放入离心机，常温离心，13000rpm，1min。吸弃上清。离心管开盖状态下，于56℃水浴中加热3min，以挥发掉未能吸尽的washbufferII。加入50～70μlEB缓冲液，充分悬浮管底的bead沉淀，盖紧管盖，于56℃水浴15min；取出离心管于14000rpm离心3min；所得上清即为DNA溶液，用移液枪将其移入新管即可；DNA置于-20℃保存备用。(二)引物设计在NCBI或其他数据库及文献中获得肿瘤易感基因突变频率较高的位点，将该基因的基因序列从NCBI中拷贝出来，选取其中一个热点突变，将原基因序列稍作改变成基因突变后的序列，利用引物设计专用的软件进行分子探针设计，分子探针设计原则为：上游正向引物的最后一位碱基与突变后位点碱基一致，或下游反向引物的反向互补序列的最后一位碱基与突变后位点碱基一致；扩增片段大小介于90～120bp之间。(三)QPCR检测以提取的ctDNA为模板，利用设计好的肿瘤易感基因SNP突变位点分子探针，对ctDNA中肿瘤易感基因进行检测。利用QPCR检测结果得到的CT值计算出每毫升血浆中该基因拷贝数。(四)检测结果说明利用基因拷贝数检测结果绘制动态曲线，根据曲线趋势评估患者治疗效果，当基因拷贝数明显下降或有下降趋势时，说明当前治疗效果有效；当基因拷贝数无明显变化或连近几次的结果相差不大时，说明患者对当前药物产生耐药性，仍可继续治疗，但必须按期复检；当基因拷贝数出现上升趋势时，说明当前治疗效果无效或患者已经对现有药物产生耐药性，建议更换治疗措施并继续观测基因拷贝数变化。优点效果：综上所述，ctDNA作为“液体活检”突破了肿瘤异质性的限制，不仅具有肿瘤早期诊断能力，在患者耐药性及复发风险的评估方面也具有重要意义。对于正在接受肿瘤治疗的患者应持续监测ctDNA动本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，其特征在于：该方法以肿瘤DNA片段为模板，设计肿瘤易感基因个性化分子探针对基因拷贝数进行QPCR检测，肿瘤患者检测周期为2周至1个月不等，根据患者化疗周期而定，绘制动态曲线，观察易感基因拷贝数变化是否出现升高或下降趋势，进而提示患者体内癌症细胞总数变化，具体包括以下步骤：人体血浆制备、肿瘤循环DNA提取、设计肿瘤易感基因个性化分子探针、QPCR检测、绘制动态曲线并对肿瘤患者体内肿瘤细胞数目变化进行监测。

【技术特征摘要】
2016.05.17 CN 20161032755561.利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，其特征在于：该方法以肿瘤DNA片段为模板，设计肿瘤易感基因个性化分子探针对基因拷贝数进行QPCR检测，肿瘤患者检测周期为2周至1个月不等，根据患者化疗周期而定，绘制动态曲线，观察易感基因拷贝数变化是否出现升高或下降趋势，进而提示患者体内癌症细胞总数变化，具体包括以下步骤：人体血浆制备、肿瘤循环DNA提取、设计肿瘤易感基因个性化分子探针、QPCR检测、绘制动态曲线并对肿瘤患者体内肿瘤细胞数目变化进行监测。2.根据权利要求1所述的利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，其特征在于：该方法的步骤如下：(一)、取已提取的血浆中ctDNA；(二)、引物设计：在NCBI或其他数据库及文献中获得肿瘤易感基因突变频率较高的位点，将该基因的基因序列从NCBI中拷贝出来，选取其中一个热点突变，将原基因序列稍作改变成基因突变后的序列，利用引物设计专用的软件进行分子探针设计，分子探针设计原则为：上游正向引物的最后一位碱基与突变后位点碱基一致，或下游反向引物的反向互补序列的最后一位碱基与突变后位点碱基一致；扩增片段大小介于90～120bp之间；(三)、QPCR检测：以提取的ctDNA为模板，利用设计好的肿瘤易感基因SNP突变位点分子探针，对ctDNA中肿瘤易感基因进行检测，利用QPCR检测结果得到的CT值计算出每毫升血浆中该基因拷贝数。3.根据权利要求2所述的利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，其特征在于：基因拷贝数计算方法如下：收集正常非肿瘤患者50例，分别提取ctDNA，并利用以上方法进行QPCR检测，检测结果得到的CT值作为Y值带入到模板制备获得的计算公式y＝kx+b中，得出X值，10x即为模板上样量2ulctDNA中所含的该基因拷贝数，利用新公式(10x×a)/2b计算出每毫升血浆中该基因拷贝数，其中a为ctDNA总体积；b为QPCR上样模板体积。4.根据权利要求2所述的利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，其特征在于：QPCR检测后进行检测结果说明：利用基因拷贝数检测结果绘制动态曲线。5.根据权利要求2所述的利用循环DNA对癌症患者的肿瘤细胞数目的监测方法，其特征在于：血浆中ctDNA提取的步骤如下(ctDNA提取试剂盒采用我公司自主研发设计的血浆中游离小片段DNA提取试剂盒进行提取)：1)EDTA抗凝管中抽取5ml静脉血；2)上下颠倒混匀，4℃运输；3)静脉血放入离心机，1600g，4...

【专利技术属性】
技术研发人员：程澎，贾世哲，
申请(专利权)人：程澎，贾世哲，
类型：发明
国别省市：辽宁;21