本发明专利技术涉及一种可用于评估药物治疗效果的Luc-LLC肿瘤模型及其建立与应用，所述肿瘤模型通过采用基因重组技术和慢病毒感染将萤火虫荧光素酶基因引入人肺腺癌LLC细胞株中，通过亚克隆筛选获得稳定表达荧光素酶的肿瘤克隆细胞株，然后采用重组的LLC细胞接种于小鼠构建而成。本发明专利技术与传统的肿瘤模型药物效果检测方法相比，观察更加直观方便，并且可进行活体观察而不损伤动物，结果更加可靠，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
可用于评估药物治疗效果的Luc-LLC肿瘤模型及其建立与应用
本专利技术属于肿瘤模型及其建立与应用领域，特别涉及一种可用于评估药物治疗效果的Luc-LLC肿瘤模型及其建立与应用。
技术介绍
肺癌是威胁我国人民健康的头号杀手。据卫生部发布的《2010年中国卫生统计年鉴》，我国2009年恶性肿瘤在所有疾病死亡原因中居首位，统计资料显示死亡率排名前十位的恶性肿瘤中，肺癌居首位，为我国的社会发展带来严重的经济负担。近年来，肺癌的治疗和基础研究取得了较大发展，但目前肺癌药物的基础和临床前研究尚欠缺一种能更方便的评估药物疗效的可靠的体内、体外研究平台，这严重制约了肺癌的基础和临床前研究。肺癌动物模型是肺癌研究的重要手段，移植性肺癌模型是目前临床前药物实验最常用的模型。 移植型肺癌模型是将人肺癌细胞移植到动物体内传代生长，移植的肿瘤细胞形态学特征、 染色体数量、同工酶水平等将保持不变，对临床抗癌药物敏感性也大致相同，移植型肺癌模型建立的常用方法是皮将肺癌细胞或组织块接种于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下(腋部、背部、后肢等)建立肺癌模型。此模型建模简单易行，成瘤率高，易监视肿瘤生长情况， 所以常用来作抗癌药物筛选的动物模型，同时该模型还具有动物来源方便、移植肿瘤细胞生长迅速、倍增时间短、耗费低等优点。但目前应用的移植型肺癌模型对药物疗效的评估多需采取解剖的方法进行评估，操作复杂，受人为操作的影响因素大，不便于临床前研究。如果能够建立一种整体可视化肺癌模型，能够直接进行体外成像监测评估肿瘤的生长转移情况，可以对活体动物进行观察，将大大便利肺癌的临床前研究，同时也能减少人为因素的干扰，提高评估的准确性。荧光素酶报告基因(Luc)的应用便利了肺癌整体可视化动物模型的构建。荧光素酶报告基因根据来源不同主要分为细菌荧光素酶(Bacterial luciferase, BL)、萤火虫荧光素酶(firefly Iuciferase1FL)以及海星、发光鱼、发光甲虫等为来源的荧光素酶，目前研究最广泛并且成为商品酶的是BL和FL。BL是由2个多肽亚基组成的异二聚体，相对分子质量约为79xl03。在还原性黄素(FMNH)、八碳以上长链脂肪醛(RCHO)和氧分子(O2)存在时，发射出蓝绿光(45(T490nm)。FL由单一的多肽链组成，相对分子质量为(60 64) XlO3, 在Mg2+、ATP、O2存在时催化D-荧光素(D-Luciferin)氧化脱羧发光(55(T580nm)。萤火虫的荧光素-荧光素酶系统是最早建立的发光模型之一，该发光系统采用荧光素底物发光的形式，不需要激发光，具有较高的灵敏度，此外，萤火虫荧光素酶发出的光组织吸收少，有利于深部组织成像，并且光的强度与标记细胞数量呈线性相关。通过基因工程方法构建荧光素酶的真核表达载体并转染到癌细胞中，使其表达萤火虫荧光素酶，进而利用表达荧光素酶的癌细胞接种至动物即可构建整体可视化肿瘤模型，可通过体外成像的方法，对动物体进行活体观察而不损伤动物。慢病毒感染较其他转染方式具有较强的优势，具有感染谱广、效率高、可感染非分4裂细胞、并可使目的基因稳定整合至宿主基因组因而能够长期表达、免疫反应小等特点，是一种高效的基因转移工具。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可用于评估药物治疗效果的Luc-LLC肿瘤模型及其建立与应用，与传统的肿瘤模型药物效果检测方法相比，观察更加直观方便，并且可进行活体观察而不损伤动物，结果更加可靠，具有良好的应用前景。本专利技术的一种可用于评估药物治疗效果的Luc-LLC肿瘤模型，所述肿瘤模型通过采用基因重组技术和慢病毒感染将萤火虫荧光素酶基因引入人肺腺癌LLC细胞株中，通过亚克隆筛选获得稳定表达荧光素酶的肿瘤克隆细胞株，然后采用重组的LLC细胞接种于小鼠构建而成。本专利技术的一种可用于评估药物治疗效果的Luc-LLC肿瘤模型的建立方法，包括(I)以前期构建的携带有萤火虫荧光素酶基因的质粒为模板扩增出荧光素酶的cDNA，通过基因克隆的方法插入慢病毒真核表达载体PRRL-CMV质粒中，构建重组质粒 Luc-PRRL-CMV 表达质粒设计萤火虫荧光素酶基因特异性引物(该引物为上游引物CCTTCTAGAATGGAAGATGCCAAAAACATTAAG;下游引物CCTGTC GACTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTTC)；荧光素酶基因的克隆和慢病毒载体的构建使用该特异性引物PCR扩增萤火虫荧光素酶基因并克隆至PCR-Blunt克隆载体中并转化大肠杆菌感受态细胞，质粒抽提后运用基因重组方法将荧光素酶目的基因片段插入慢病毒真核表达载体PRRL-CMV空质粒中并转化大肠杆菌感受态细胞；质粒抽提后进行双酶切和测序证实构建的表达载体的正确性；(2)慢病毒感染方法将荧光素酶外源基因导入肺癌细胞株的步骤大肠杆菌扩增荧光素酶慢病毒载体和慢病毒包装质粒，并纯化测定浓度；将荧光素酶慢病毒载体的包装荧光素酶慢病毒表达载体与慢病毒包装质粒混合后，用转染试剂共转染293T细胞，以产生含有萤火虫荧光素酶慢病毒颗粒的上清，确定慢病毒颗粒的滴度；病毒感染以人肺腺癌LLC为母细胞，用上述病毒上清进行感染；扩增建系进行细胞亚克隆筛选，检测单克隆细胞内的荧光表达情况，筛选出稳定表达荧光素酶报告基因的重组细胞株并进行扩大培养；(3)肿瘤皮下注射方法将得到的重组人肺腺癌细胞经消化后重悬于氯化钠溶液中(200 μ 1)，在裸鼠皮下接种(2Χ IO6)该重组人肺腺癌细胞，监测细胞皮下增殖情况，即得到可用于评估药物治疗效果的Luc-LLC肿瘤模型。所述步骤(I)中的基因重组方法为酶切和连接；其中，酶切具体为采用Xba I和 Sal I双酶切。所述步骤(2)中的荧光素酶慢病毒表达载体与慢病毒包装质粒的质量比为1:3、 1:6 或 1:9。所述慢病毒包装质粒包括第三代慢病毒复制所需要的三个基因gag、pol和rev。所述步骤(2)中的转染试剂为MV40转染试剂。所述步骤(2)中通过ELISA法确定慢病毒颗粒的滴度；通过细胞有限稀释法进行细胞亚克隆筛选；通过荧光测定仪或活细胞成像仪检测单克隆细胞内的荧光表达情况。所述步骤(3)中的氯化钠溶液质量百分比浓度为O. 9%。所述步骤(3)中通过游标卡尺测量和活体成像仪监测细胞皮下增殖情况。本专利技术的裸鼠模型应用于观察肿瘤的生长情况和抗肿瘤药物的治疗效果。所选用的动物除了裸鼠，也可以为SCID鼠。有益.效果本专利技术与传统的肿瘤模型药物效果检测方法相比，观察更加直观方便，并且可进行活体观察而不损伤动物，结果更加可靠，具有良好的应用前景。附图说明图IA为萤火虫荧光素酶Luciferase慢病毒载体示意图IB为质粒酶切鉴定图2为Luciferase慢病毒载体的包装；其中，A为目的基因质粒与慢病毒包装质粒按1:3转染293T细胞，B为目的基因质粒与慢病毒包装质粒按1:6转染293T细胞，C为目的基因质粒与慢病毒包装质粒按1:9转染293T细胞；图3为包装后的慢病毒上清感染LLC细胞；其中，A为感染后48h ;B为感染后72h ； C为感染后96h ；图4为稳定表达Luciferase的LLC细胞单克隆筛选；其中,A为Luciferase活性定量分析(RLU)，B为活细胞成像；图本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可用于评估药物治疗效果的Luc?LLC肿瘤模型，其特征在于：所述肿瘤模型通过采用基因重组技术和慢病毒感染将萤火虫荧光素酶基因引入人肺腺癌LLC细胞株中，通过亚克隆筛选获得稳定表达荧光素酶的肿瘤克隆细胞株，然后采用重组的LLC细胞接种于小鼠构建而成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：房健民，周爽，杨洋，李栋，
申请(专利权)人：同济大学苏州研究院，
类型：发明
国别省市：
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