taqman探针法进行TP53易感基因筛查的方法及使用的探针和引物技术

本发明专利技术提供了一种taqman探针法进行TP53易感基因筛查的方法，包括如下步骤：本发明专利技术所述的检测方法包括以下步骤：(1)正常人群口腔拭子基因组提取；(2)设计TP53引物及探针；(3)使用TP53的引物和探针对基因组进行PCR反应；(4)PCR结束后进行荧光读取，并进行基因分型；(5)综合4个探针检测的结果，对个体的肿瘤易感性进行综合评估。本发明专利技术的taqman引物及探针具有良好的分型效果，能非常准确的确定个体的基因型。

TaqMan probe method for TP53 susceptibility gene screening and probes and primers used

The present invention provides a method of TaqMan probe method for TP53 susceptible gene screening, including the following steps: the detection method of the present invention includes the following steps: (1) a normal population of oral swab genome extraction; (2) designing TP53 primers and probes; (3) using TP53 primers and probes for PCR reaction to the genome; (4) PCR junction Fluorescence detection was performed after the beam and genotyping was performed. (5) the results of 4 probe tests were combined to evaluate the susceptibility of individual tumors. The TaqMan primers and probes of the invention have good typing effect and can determine the genotype of individuals very accurately.

【技术实现步骤摘要】
taqman探针法进行TP53易感基因筛查的方法及使用的探针和引物
本专利技术涉及肿瘤易感基因筛查与荧光定量PCR的方法，尤其涉及一种taqman探针法进行TP53易感基因筛查的方法。
技术介绍
癌症是二十一世纪人类健康最大的威胁，虽然环境与生活习惯对癌症的发生有重要影响，但从本质上讲癌症是一种基因病，遗传因素增加了我们对癌症的易感性。通俗讲就是单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)，其主要指在基因组水平上，由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。是一种十分理想、有效的分子标记。TP53基因翻译的P53蛋白是细胞生长、增殖和损伤修复的重要调节因子。TP53基因是一种抑癌基因，在正常细胞中低表达，在恶性肿瘤中高表达，其定位于人类第17号染色体的短臂上，编码和表达TP53蛋白，是细胞生长周期中的调节因子，与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能相关联。野生型TP53蛋白可抑制带有DNA损伤和染色体畸变的细胞发生分裂，从而阻止畸变传递给子细胞，具有广谱的肿瘤抑制作用。相反TP53基因的突变(缺失)则与肿瘤的发生、发展有密切关系，因此TP53被誉为基因卫士。故我们选择TP53基因作为易感基因筛查的目标。目前易感基因筛查的主要手段为一代测序、二代测序及荧光定量PCR。一代及二代测序虽然准确性比较高，但成本高昂，耗时较长。taqman探针法检测SNP位点具有快速、准确、成本低等一系列优点。在PCR反应系统中加入2种不同荧光标记的探针，它们可分别与2个等位基因完全配对。正常情况下，由于探针5′端荧光基团和3′端淬灭基团紧邻在一起，荧光被淬灭。随着PCR的有效进行，与模板完全配对的探针逐步被TaqDNA聚合酶5′→3′外切酶活性切割，致使探针5′端上的荧光基团与3′端的淬灭基团分离，淬灭效应解除，报告荧光基团被激活；而与模板不能完全配对的探针，表明另一对等位基因不能被有效切割，故检测不到荧光信号，通过相应仪器检测荧光值的变化即可实现SNP位点检测，如图1所示。
技术实现思路
为了解决本领域存在的问题，本专利技术提供了一种taqman探针法进行TP53易感基因筛查的方法及所使用的探针和引物。本专利技术的目的是通过以下方案实现：一种taqman探针法进行TP53易感基因筛查的方法，包括如下步骤：(1)口腔拭子基因组提取；(2)确定TP53引物及探针；(3)使用TP53的引物和探针对步骤(1)的基因组进行PCR反应；(4)PCR结束后进行荧光读取，并进行基因分型；(5)综合探针检测的结果，对个体的肿瘤易感性进行综合评估。优选地，所述步骤(1)中的提取方法为使用口腔拭子刮取口腔黏膜细胞，使用100ul口腔拭子保存液保存，经400ml细胞裂解液与40ul、20ug/ul蛋白酶k裂解细胞释放出基因组DNA，后选择性沉淀去除蛋白，纯净的基因组DNA溶解于50ulTEbuffer中备用；所述。优选地，所述步骤(2)中的引物包括TP53基因上的rs78378222、rs12951053、rs2287498、rs2078486SNP位点的引物。优选地，所述各SNP位点的引物如下表所示：优选地，所述各SNP位点的探针如下表所示：优选地，所述步骤(3)的PCR反应体系为10μl：优选地，所述PCR条件为：95℃15min，95℃20sec，60℃1min，40个循环，72℃5min。本专利技术的另一方面为用于Taqman探针法进行TP53易感基因筛查的引物和探针，所述引物包括TP53基因上的rs78378222、rs12951053、rs2287498、rs2078486SNP位点的引物。优选地，所述各SNP位点的引物如下表所示：优选地，所述各SNP位点的探针如下表所示：本专利技术提供的利用TaqmanMGB探针检测人TP53基因多态性的方法，能高通量检测其SNP位点，结果容易判读。每次可以检测384个样品，且不需要进行PCR产物的后续分析，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测效率。本专利技术使用的引物和探针特异性强，不会受到其他基因的干扰，降低了PCR产物污染引起假阳性的风险，并且结果判读更容易。可对TP53基因的SNP位点实现高通量检测，在对人进行易感基因检测中具有潜在的应用价值。附图说明图1是Taqman探针检测SNP的技术原理图；图2是rs78378222SNP位点有3个基因型GG、GT和TT的检测结果，其中GG基因型在图形的左上方，GT位于中间位置，TT位于右下方；图3是rs12951053SNP位点有3个基因型AA、AC、CC的检测结果，其中AA基因型位于图形的左上方，AC基因型位于中间位置，CC基因型位于右下方。具体实施方式下面结合附图，对本专利技术进行详细的解释。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1利用TaqmanMGB探针检测人TP53rs78378222位点基因多态性的方法1、实验材料选取经过TP53一代测序的健康人群为检测对象。2、基因组DNA的提取使用口腔拭子刮取口腔黏膜细胞，首先使用口腔拭子保存液保存，细胞裂解液裂解细胞释放出基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。基因组DNA的提取不仅限于此种方法，使用其他方法提取的基因组DNA也在本实验的研究范围内。3、TaqmanMGB探针法进行基因分型，使用rs78378222位点引物和探针对进行检测。针对17号染色体7571752位点的核苷酸进行引物和探针设计。所述基因的引物的核苷酸序列如下所示：正向引物：5'-GCCTGCACTGGCGTTCAC-3'反向引物：5'-TCCCCTCCTTCTCCCTTTTTAT-3'；所述探针的核苷酸序列如下：P1-G：5'-FAM-CAGCAAAGTTGTATTG-MGB-3'P1-T：5'-VIC-CAGCAAAGTTTTATTGTA-MGB-3'；引物和探针由擎科生物公司合成，采用购自康为公司的2XGoldStarMasterMix(Dye)，PCR仪型号为ABI7500实时荧光定量PCR系统。反应体系：以提取的基因组DNA为模板，以上述合成的引物和探针在荧光定量PCR系统中如下表所示进行扩增(10μL反应体系)：具体实施步骤如下：(1)考虑到移液器及吸头的误差，一般每个96孔板按105个反应计算体系，配制好mix。(2)每个96孔板设置一个空白对照NTC，设置两个已知GG型TP53基因组对照，一个已知GT型TP53基因组对照，一个已知TT型TP53基因组对照。(3)应用排枪在每孔中加1μLDNA样品。(4)完成后用封口膜封口，平板离心机离心。(5)开启ABI7500实时荧光定量PCR系统，设置参数，反应条件如下：95℃15min，95℃20sec，60℃1min，40个循环，72℃5min，60℃是读荧光.4、分析结果应用ABI750本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种taqman探针法进行TP53易感基因筛查的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)口腔拭子基因组提取；(2)确定TP53引物及探针；(3)使用TP53的引物和探针对步骤(1)的基因组进行PCR反应；(4)PCR结束后进行荧光读取，并进行基因分型；(5)综合探针检测的结果，对个体的肿瘤易感性进行综合评估。

【技术特征摘要】
1.一种taqman探针法进行TP53易感基因筛查的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)口腔拭子基因组提取；(2)确定TP53引物及探针；(3)使用TP53的引物和探针对步骤(1)的基因组进行PCR反应；(4)PCR结束后进行荧光读取，并进行基因分型；(5)综合探针检测的结果，对个体的肿瘤易感性进行综合评估。2.根据权利要求1所述的taqman探针法进行TP53易感基因筛查的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的提取方法为使用口腔拭子刮取口腔黏膜细胞，使用100ul口腔拭子保存液保存，经400ml细胞裂解液与40ul、20ug/ul蛋白酶k裂解细胞释放出基因组DNA，后选择性沉淀去除蛋白，纯净的基因组DNA溶解于50ulTEbuffer中备用；所述。3.根据权利要求1所述的taqman探针法进行TP53易感基因筛查的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的引物包括TP53基因上的rs78378222、rs12951053、rs2287498、rs2078486SNP位点的引物。4.根据权利要求3所述的taqman...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭新雨，肖哲，焦少灼，戚珠云，郑乃中，陈增辉，王琦童，温稳，
申请(专利权)人：美因健康科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11