GINS4基因或GINS4蛋白作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了GINS4基因或GINS4蛋白可用于制备肺腺癌的预诊断试剂和试剂盒、预后评估标志物及治疗药物等。本发明专利技术从肺腺癌和正常肺组织样本中抽提RNA后逆转录，实时荧光定量PCR技术检测其中GINS4的表达，结果显示GINS4在肺腺癌组织中高表达。提示GINS4可作为肺腺癌预诊断的分子标志物。本发明专利技术为肺腺癌的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

Application of GINS4 gene or GINS4 protein as biomarker in preparation of pre diagnostic reagents for lung adenocarcinoma

The invention discloses a GINS4 gene or a GINS4 protein, which can be used as a pre diagnostic reagent and kit for the preparation of lung adenocarcinoma, a prognostic marker and a therapeutic drug. RNA retrotranscriptase was extracted from lung adenocarcinoma and normal lung tissue samples, and the expression of GINS4 was detected by real time fluorescence quantitative PCR. The results showed that GINS4 was highly expressed in lung adenocarcinoma tissue. It is suggested that GINS4 can be used as a molecular marker for pre diagnosis of lung adenocarcinoma. The invention provides a powerful molecular biological tool for the auxiliary diagnosis and prognosis prediction of lung adenocarcinoma. It has far-reaching clinical significance and important prospects for popularization and application.

【技术实现步骤摘要】
GINS4基因或GINS4蛋白作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂中的应用
本专利技术属于生物
，涉及GINS4基因或GINS4蛋白在制备肺癌诊断、预后评估及治疗的应用，具体涉及GINS4基因或GINS4蛋白作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂中的应用。
技术介绍
肺癌是全球范围最常见、死亡率最高的恶性肿瘤，我国肺癌形势同样相当严峻，2015年我国肺癌新发73.33万例，死亡61.02万例，是我国第一大恶性肿瘤。肺癌根据组织学类型可分为小细胞肺癌(SCLC)及非小细胞肺癌(NSCLC)，后者可细分为肺腺癌、肺鳞癌和大细胞肺癌，其中肺腺癌占所有肺癌的50％以上，是主要的病理类型。多数肺腺癌起源于较小的支气管，为周围型肺癌，故患者早期多无明显的临床症状，但部分患者可出现早期的血行转移，且绝大多数患者在确诊时已属相对晚期，导致患者失去根治性手术的机会。因此，早期诊断和及早治疗对肺腺癌者的疗效与预后至关重要。GINS4基因位于染色体8p11.21上，是促进哺乳动物胚胎发育的重要分子，其与Psf1、Psf2及Psf3共同组成GINS复合物，该复合物可进一步与细胞分裂周期蛋白45(celldivisioncycle45，CDC45)及微小染色体维持蛋白(mini-chromosomemaintenancehelicase，MCM)相互作用，共同参与DNA解旋过程，调控细胞增殖。近年有研究显示，GINS复合物相关组分在多种恶性肿瘤中表达异常且影响细胞恶性行为：其中Psf1在前列腺癌中高表达，且与患者肿瘤分级、临床分期以及不良预后均显著正相关，Psf1同样也高表达于非小细胞肺癌，体外干扰Psf1后可抑制A549及H1299细胞增殖。Psf3在肺腺癌中高表达，且与患者预后低生存率显著正相关。GINS4在膀胱癌中高表达，体内外敲除GINS4可抑制膀胱癌细胞的增殖能力；GINS4也高表达于结直肠癌组织中，且GINS4高表达与患者淋巴结转移及预后不良存在密切关系。但GINS4在肺腺癌中的具体生物学作用及与患者病情及预后的关系尚不明确。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供GINS4基因或蛋白在制备肺腺癌诊断、预后评估及应用。专利技术人研究发现，GINS4基因编码的GINS4蛋白在肺腺癌中的表达明显升高，促进了肿瘤细胞恶性增殖及侵袭迁移的能力，在肺腺癌的发生发展中发挥重要作用。因此，GINS4基因或蛋白可成为肺腺癌诊断及预后评估的新标志物，且可作为新的分子靶向位点开展临床治疗工作。GINS4高表达于胚胎组织，在物种进化过程中十分保守，成熟个体中仅高表达于骨髓组织，在肺组织中表达较低。我们的研究显示GINS4在肺腺癌组织中异常高表达，通过kaplanmeier-plotter(www.kmplot.com)数据库中数据分析，发现高表达GINS4的肺腺癌患者预后相比低表达患者显著较差。通过本专利技术专利技术人的研究表明，GINS4基因或蛋白作为生物标志物可用于制备肺腺癌的预诊断试剂和试剂盒，制备肺腺癌的预诊断预后评估试剂或治疗药物等。本专利技术还提供了检测肺腺癌的试剂盒，所述试剂盒中含有如下引物对：用于实时荧光定量检测GINS4基因表达的引物对：正向引物：5’-TCAAGCCTGTAATCCCAGCA-3’(SEQIDNO.1)；反向引物：5’-GTTCAAGCGATTCTCCTGCC-3’(SEQIDNO.2)；内参基因β-Actin特异性PCR引物对：正向引物：5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’(SEQIDNO.3)；反向引物：5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’(SEQIDNO.4)。所述试剂盒中还包括：从肺腺癌组织中抽提总RNA所用试剂；以总RNA为模版将GINS4逆转录为cDNA的试剂；将cDNA进行实时荧光定量PCR的试剂。所述从肺腺癌组织中抽提总RNA所用试剂包括RNAisoPlus、三氯甲烷、异丙醇、体积百分比浓度为75％的乙醇、无核酶水；以总RNA为模版将GINS4逆转录为cDNA的试剂包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及随机引物；将cDNA进行实时荧光定量PCR的试剂包括实时荧光定量SYBRGreen染料、无核酶水。总之，本专利技术从肺腺癌和正常肺组织样本中抽提RNA后逆转录，实时荧光定量法检测GINS4的表达，结果显示GINS4在肺腺癌组织中高表达。提示GINS4可作为肺腺癌预诊断的分子标志物。本专利技术为肺腺癌的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。附图说明图1为实时荧光定量PCR技术检测GINS4在肺腺癌及癌旁组织中的表达情况，结果显示肺腺癌中GINS4的表达相比正常肺组织中显著提高；图2为肺腺癌中GINS4表达与患者预后的关系，结果显示高表达GINS4的患者总生存率相比低表达患者显著降低；图3为在肺腺癌细胞H1299中转染干扰GINS4表达载体，显著降低H1299细胞中GINS4的表达；图4为干扰H1299细胞GINS4表达后，细胞增殖能力显著下降；图5为干扰H1299细胞GINS4表达后，细胞侵袭迁移能力显著下降；具体实施方式实施例1实时荧光定量PCR法检测GINS4在肺腺癌中的高表达：1.材料与方法1.1材料RNA提取试剂Trizol(#9109，Takara)；逆转录试剂盒(#A3500，Promega)；PremixExTaqTM荧光染料(#RR420A，Takara)；无核酶水(#10977023，Invitrogen)。1.2方法收集43对肺腺癌及癌旁组织，抽提总RNA，取1μg行逆转录得到cDNA模板，实时荧光定量PCR技术检测两种组织中GINS4表达水平。GINS4基因正向引物：5’-TCAAGCCTGTAATCCCAGCA-3’；反向引物：5’-GTTCAAGCGATTCTCCTGCC-3’；内参基因β-Actin正向引物：5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’；反向引物：5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’。实时荧光定量PCR反应体系如下：PremixExTaqTM(2×)10μL、PCRPrimer(1μM)5μl、cDNA模板(1μg/ml)5μl，总体积20μl实时荧光定量PCR反应步骤：反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(thresholdcyclevalues)、内参基因(β-Actin)标化后，采用groupt-test检验计算P值。2.结果肺腺癌组织中GINS4表达水平显著高于癌旁组织，见图1。实施例2利用kaplanmeier-plotter(www.kmplot.com)数据库分析GINS4表达与患者预后的关系：结果显示GINS4高表达患者总生存率相比低表达患者显著降低，见图2。实施例3构建稳定干扰GINS4的H1299肺腺癌细胞系：1.材料与方法1.1材料人肺腺癌细胞H1299及人胚肾细胞293T(ATCC)；DMEM培养基、1640培养基、胎牛血清及胰蛋白酶(Gibco)慢病毒小干扰RNA(siRNA)GINS4载体(上海吉凯基因)；慢病毒包装载体pSPAX2本文档来自技高网...

【技术保护点】
GINS4基因或GINS4蛋白作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂中的应用；所述GINS4蛋白由GINS4基因编码。

【技术特征摘要】
1.GINS4基因或GINS4蛋白作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂中的应用；所述GINS4蛋白由GINS4基因编码。2.GINS4基因或GINS4蛋白作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂盒中的应用；所述GINS4蛋白由GINS4基因编码。3.GINS4基因或GINS4蛋白作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断预后评估试剂或治疗药物中的应用；所述GINS4蛋白由GINS4基因编码。4.一种检测肺腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如下引物对：用于实时荧光定量检测GINS4基因表达的引物对：正向引物：5’-TCAAGCCTGTAATCCCAGCA-3’；反向引物：5’-GTTCAAGCGATTCTCCTGCC-3’；内参基因β-Actin特异性PCR引物对：正向引物：5’-CA...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶永光，杨瑞，
申请(专利权)人：中南大学，杨瑞，
类型：发明
国别省市：湖南,43