一种源于CCKBR基因的单体型AAG/GGC及其应用制造技术

一种源于CCKBR基因的单体型AAG/GGC及其应用。本发明专利技术公开了一对与成人神经胶质瘤、原发性肝细胞癌和非小细胞肺癌易感性相关，起源于基因CCKBR突变的基因单体型AAG和GGC（rs2929183‑rs2941023‑rs2947025）。本发明专利技术通过设计PCR扩增引物和荧光探针来特异性检测三个SNP位点rs2929183，rs2941023和rs2947025的基因型，并应用连锁不平衡软件进行基因型分析和遗传作图，并计算基因型和单体型与成人神经胶质瘤、原发性肝细胞癌和非小细胞肺癌易感性的关系，从而对这三种肿瘤进行易感性评估。所述PCR扩增引物和荧光探针的序列依次如SEQ ID NO：4～15所示；本发明专利技术的引物组和检测方法简单、快速、高通量、高敏感、特异性强，适用于成人神经胶质瘤、原发性肝细胞癌和非小细胞肺癌易感人群的大规模筛查，有利于指导相关肿瘤的预防，具有较大的应用前景。

Haplotype AAG/GGC derived from CCKBR gene and its application

A haplotype AAG/GGC derived from the CCKBR gene and its application. The invention discloses a pair of genes related to the susceptibility to adult glioma, primary hepatocellular carcinoma and non-small cell lung cancer, and the gene haplotype AAG and GGC (rs2929183 rs2941023 rs2947025), which are derived from the gene CCKBR mutation. The genotypes of three SNP loci rs2929183, rs2941023 and rs2947025 were specifically detected by the design of PCR amplification primers and fluorescence probes, and the genotype and haplotype and adult glioma, primary hepatocellular carcinoma and non small cell lung were calculated by using linkage disequilibrium software for genotype analysis and genetic mapping. The relationship between cancer susceptibility and susceptibility to these three tumors is assessed. The sequence of PCR amplification primers and fluorescent probes is in turn as shown in SEQ ID NO:4 ~ 15. The primer group and detection method of the invention are simple, fast, high throughput, Gao Min sense and strong specificity, and are suitable for large-scale screening of adult neuroglioma, primary hepatocellular carcinoma and non small cell lung cancer susceptible population, which is beneficial to guidance. The prevention of relative tumor has great application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种源于CCKBR基因的单体型AAG/GGC及其应用
本专利技术属于生物
更具体地，涉及一对与成人神经胶质瘤、原发性肝细胞癌和非小细胞肺癌易感性相关的基因单体型AAG/GGC及其应用。
技术介绍
神经胶质瘤(gliomas)亦称胶质细胞瘤，简称胶质瘤，是发生于神经外胚层的肿瘤，故亦称神经外胚层肿瘤或神经上皮肿瘤。神经胶质瘤在颅内各种肿瘤中最为多见(约占50％)；在儿童恶性肿瘤中排第二位。近30年来，原发性恶性脑肿瘤发生率逐年递增，年增长率约为1.2％，中老年人群尤为明显。据文献报道，中国脑胶质瘤年发病率为3～6人/10万人，年死亡人数达3万人。在神经胶质瘤中以星形细胞瘤为最常见，其次为多形性胶质母细胞瘤，室管膜瘤占第三位。性别以男性多见，特别在多形性胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤中，男性明显多于女性。年龄大多见于20～50岁间，以30～40岁为最高峰，另外在10岁左右儿童亦较多见，为另一个小高峰。作为中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，具有恶性程度高和侵袭性强的特点。现有资料表明，保守治疗的胶质瘤患者，平均生存期为14周；单纯外科手术能将这一时间延长到20周；手术和放疗结合可达36周；手术、放疗、化疗综合治疗也仅达40周，预后仍然很差。原发性肝细胞癌起源于肝脏的上皮组织，是我国高发的、危害极大的恶性肿瘤。原发性肝癌的病因及确切分子机制尚不完全清楚，目前认为其发病是多因素、多步骤的复杂过程，受环境和因此双重因素影响。最新国际流行病学的调查显示，目前每年的肝癌发病率全世界是74.83万，大约55％都在中国。90％左右的中国肝癌患者是肝细胞肝癌，它的主要发病相关因素是乙型肝炎病毒(HBV)引起的肝炎，肝炎以后的肝硬化，肝硬化以后转变的肝癌。此外，丙型肝炎病毒(HCV)感染、黄曲霉素、饮水污染、酒精、肝硬化、性激素、亚硝胺类物质、微量元素等都与肝癌发病相关。肺癌是一种常见的肺部恶性肿瘤，绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮。非小细胞型肺癌包括鳞状细胞癌(鳞癌)、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80％，约75％的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确，大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生有非常密切的关系。已有的研究证明：长期大量吸烟者患肺癌的概率是不吸烟者的10～20倍，开始吸烟的年龄越小，患肺癌的几率越高。此外，吸烟不仅直接影响本人的身体健康，还对周围人群的健康产生不良影响，导致被动吸烟者肺癌患病率明显增加。城市居民肺癌的发病率比农村高，这可能与城市大气污染和烟尘中含有致癌物质有关。因此应该提倡不吸烟，并加强城市环境卫生工作。因此，本项目以神经胶质瘤、原发性肝细胞癌和非小细胞肺癌这三种恶性肿瘤为研究对象，具有重要的意义。功能基因组学(Functionalgenomics)的进展告诉我们，基因的特定遗传改变可导致控制细胞生长的相应基因(包括自身或与之相互作用的其它基因)功能发生改变。因此，与恶性肿瘤发生和发展过程相关的基因遗传变异，比如占到人类90％变异的单核苷酸多态性(single-nucleotidepolymorphisms,SNPs)，也许有助于预测个体患病的易感性和早期诊断。SNPs指的是由单个核苷酸—A，T，C或G的改变而引起的DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。例如，来自两个不同个体的DNA片段，AAGCCTA和AAGCTTA为等位基因。几乎所有常见的SNP位点都只有两个等位基因。SNP是形成的遗传标记，是在群体中可以稳定保留下来的单碱基突变。一般来说SNP具有一定的遗传性，是基因组DNA序列中的单个核苷酸(ATGC)的突变而引起的物种多态性。SNP位点的分布是不均匀的，在非编码区比在编码区更常见。一般来说，自然选择倾向于保留最利于遗传适应性的SNP位点。SNP作为基因组最广泛存在的一类多态性标记，它以高密度以及二态性所适宜的快速、大规模的筛查和易于分型的特点决定了它比其他多态性标志更适合对复杂性疾病的研究。证据表明，SNP对疾病、毒物的易感性和耐受性、疾病临床表型的多样性，以及对药物治疗的反应性都有着重要的影响。位于一条染色体上或某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单体型(haplotype)。SNP位点并不是独立遗传的，而是在染色体上倾向于以一个整体遗传给后代。成组遗传的SNP位点在一代又一代的遗传中绝少发生重组。于是，这样的一组SNP位点类型也就是单体型。研究者一般通过比较患者和非患者来发现影响某种疾病的基因。在单体型频率不同的染色体区域，就有可能包含疾病相关基因。传统经典的SNP基因分型方法是以凝胶电泳为基础的，如PCR-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)、单链构象多态性法(SSCP)等，这些方法虽然成本较低，但由于低通量和特异性较低等原因，基本已经退出历史舞台。另一大类检测方法是近些年来发展起来的高通量、自动化程度较高的方法，较为常见的有DNA测序法、芯片法、质谱法、高分辨率熔解曲线(HRM)法等。这些方法的最大优点是高通量、高特异性，但是价格比较昂贵，耗时长、操作繁琐、对技术要求较高等因素，并不适用于临床推广。而应用于SNP检测的实时荧光定量PCR技术，可以综合上述两方面的优点，即特异性高、操着较简单、中通量，并且成本较低。可利用荧光定量PCR技术研发快速检测疾病易感性的试剂盒，适于临床实验室推广。人类胆囊收缩素B受体(cholecystokininBreceptor,CCKBR)位于染色体11p15.4，全长12454bp，mRNA长度2206bp，有5个外显子和4个内含子。该受体主要存在于中枢神经系统和消化系统，调节多巴胺并影响大脑神经递质的传递，调节精神焦虑、运动和摄食。研究显示，CCKBR在神经胶质瘤、肝细胞癌和非小细胞肺癌这三种恶性肿瘤中的表达均有不同程度的升高。目前，还尚未有关于CCKBR基因多态性位点与肿瘤易感性的检测方法和检测试剂盒的报道。若能通过找寻CCKBR基因上的多态位点来进行恶性肿瘤易感人群的大规模筛查，可以逐步实现对癌症的早发现、早诊断、早治疗，有效推进癌症防控事业的发展。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术中神经胶质瘤、肝细胞癌和非小细胞肺癌易感人群筛查存在的缺陷和不足，提供一种与神经胶质瘤、原发性肝细胞癌和非小细胞肺癌易感性相关的，来源于CCKBR基因的SNPs位点rs2929183、rs2941023和rs2947025及其组成的基因单体型AAG和GGC在检测神经胶质瘤、原发性肝细胞癌和非小细胞肺癌易感性中的应用。本专利技术的第一个目的是提供来源于CCKBR基因的SNPs位点rs2929183、rs2941023和rs2947025，或其基因单体型AAG和GGC。本专利技术的第二个目的是提供SNPs位点rs2929183、rs2941023和rs2947025，或其基因单体型AAG和GGC的应用。本专利技术的第三个目的是提供一种检测rs2929本文档来自技高网...

【技术保护点】
起源于CCKBR基因的SNP位点rs2929183，rs2941023和rs2947025，或rs2929183‑rs2941023‑rs2947025位点所构成的基因连锁不平衡单体型AAG和单体型GGC，其特征在于，所述单体型在rs2929183、rs2941023和rs2947025位点的单核苷酸分别为A、A、G或G、G、C。

【技术特征摘要】
1.起源于CCKBR基因的SNP位点rs2929183，rs2941023和rs2947025，或rs2929183-rs2941023-rs2947025位点所构成的基因连锁不平衡单体型AAG和单体型GGC，其特征在于，所述单体型在rs2929183、rs2941023和rs2947025位点的单核苷酸分别为A、A、G或G、G、C。2.权利要求1所述的SNP位点rs2929183，rs2941023和rs2947025，或单体型AAG和GGC在作为神经胶质瘤、原发性肝细胞癌和非小细胞肺癌易感性评估的标志物和/或在制备神经胶质瘤、原发性肝细胞癌和非小细胞肺癌易感性检测试剂盒中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为通过SNP基因分型技术测定个体样本rs2929183、rs2941023和rs2947025位点的基因型，并遗传作图，当此三位点的单体型为AAG，则该个体不是神经胶质瘤、原发性肝细胞癌和非小细胞肺癌的易感群体，当此三位点的单体型为GGC，则该个体可能为神经胶质瘤、原发性肝细胞癌和非小细胞肺癌的易感人群。4.一种检测rs2929183、rs2941023和rs2947025位点基因型的引物组，其特征在于，每个位点的检测引物组均包括一对PCR扩增引物及两条荧光探针，其序列依次如SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱萧，罗辉，陈志红，罗海清，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44