CYP2D6基因检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及基因工程及分子生物学领域，一种CYP2D6基因检测试剂盒，包括用于对含rs1801253位点的核酸片段进行特异性扩增的引物组，所述引物组包括上游引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4，以及下游引物SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8。本发明专利技术还提供了一种基因检测方法。本发明专利技术的试剂盒通过采用特异性扩增引物组对含上述rs1801253位点的核酸片段进行扩增，使得对CYP2D6基因突变的检测灵敏度高、假阳性率低；本发明专利技术的试剂盒采用第二代高通量基因测序技术进行检测，使得检测周期短，通量高。

CYP2D6 gene detection kit and detection method

The invention relates to the field of genetic engineering and molecular biology, a CYP2D6 gene detection kit, including a primer group for specific amplification of nucleic acid fragments containing rs1801253 loci, which include the upstream primers SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 NO:3 or SEQ polymerase, and downstream primers O:5, SEQ, ID, NO:6, SEQ ID ID NO:7 or SEQ ID ID NO:8. The invention also provides a method for gene detection. The kit of the invention is used to amplify the nucleic acid fragment containing the rs1801253 site by the specific amplification primer group, so that the detection sensitivity and false positive rate of the CYP2D6 gene mutation are high and the false positive rate is low. The kit of the invention is tested by second generation high throughput gene sequencing technology, so that the detection cycle is short and the flux is high.

【技术实现步骤摘要】
CYP2D6基因检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及基因工程及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种CYP2D6基因检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
细胞色素P450（CYP）家族是药物Ⅰ相代谢酶中一种重要的酶系，在生物体内的内源性物质和外源性物质的代谢中发挥重要作用。CYP2D6基因是CYP酶家族重要的成员之一，虽然只占肝脏酶总量的2~9%，却参与20~30%药物的代谢，包括抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药、镇痛药等。通过对患者的CYP2D6基因进行检测，得到特定位点的基因型，以基因检测结果作为中间结果的信息的方法，不属于疾病的诊断方法；以基因型的检测结果来确定药物的选择，就可以实现个体化用药，避免对免疫抑制剂不良反应。CYP2D6基因的10号等位基因区域是CYP2D6基因的一个重要的基因型区域，且51.6%的中国人具有CYP2D6基因10号等位基因型。CYP2D6基因10号等位基因区域的rs1801253位点突变会导致形成活性低且不稳定的代谢酶。目前常用的CYP2D6基因突变检测方法主要采用Taqman荧光探针法法。但Taqman荧光探针法灵敏度低、假阳性率高、耗时较长，通量小。因此，需要一种新的检测CYP2D6基因基因突变的试剂盒及检测方法，使得对CYP2D6基因突变的灵敏度高，假阳性率高，且检测周期短。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种CYP2D6基因检测试剂盒及检测方法，旨在解决现有技术中CYP2D6基因检测灵敏度低、假阳性率高、周期长，通量小的技术问题。一种CYP2D6基因检测试剂盒，包括用于对含rs1801253位点的核酸片段进行特异性扩增的引物组，所述引物组包括上游引物SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4，以及下游引物SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8。优选的，所述基因检测试剂盒还包括接头，所述接头包括接头A、接头B、接头C、接头D中的至少一种；所述接头A由SEQIDNO:9和SEQIDNO:10组成；所述接头B由SEQIDNO:11和SEQIDNO:12组成；所述接头C由SEQIDNO:13和SEQIDNO:14组成；所述接头D由SEQIDNO:15和SEQIDNO:16组成。优选的，所述基因检测试剂盒还包括测序引物SEQIDNO:17，所述测序引物用于对含rs1801253位点的文库分子进行测序。优选的，所述测序引物的5’末端经过磷酸化修饰。一种基因检测方法，包括以下步骤：A、利用扩增引物组，对含rs1801253位点的样本进行扩增，得扩增产物；其特征在于，所述引物组包括上游引物SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4，以及下游引物SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8；B、在所述扩增产物上连接接头，得到文库分子；C、采用第二代高通量基因测序技术对所述文库分子进行测序，确定rs1801253位点的基因型。优选的，所述步骤A包括以下步骤：A1、采用第一引物组扩增CYP2D6基因10号等位基因区域，得第一扩增产物；所述第一引物组包括第一上游引物SEQIDNO:1或SEQIDNO:2，以及第一下游引物SEQIDNO:5或SEQIDNO:6；；A2、以第一扩增产物为模板，采用第二引物组扩增含rs1801253位点的核酸片段，得第二扩增产物；所述第二引物组包括第二上游引物SEQIDNO:3或SEQIDNO:4，以及第二下游引物SEQIDNO:7或SEQIDNO:8。优选的，所述步骤B中还包括向第二扩增产物中加入USER酶进行切割的步骤，所述第二扩增产物经USER酶切割形成第一粘性末端。优选的，所述接头包括接头A、接头B、接头C、接头D中的至少一种；所述接头A由SEQIDNO:9和SEQIDNO:10组成；所述接头B由SEQIDNO:11和SEQIDNO:12组成；所述接头C由SEQIDNO:13和SEQIDNO:14组成；所述接头D由SEQIDNO:15和SEQIDNO:16组成。优选的，步骤C中用于对含rs1801253位点的文库分子进行测序的测序引物为SEQIDNO:17。优选的，所述测序引物的5’末端经过磷酸化修饰。本专利技术提供的CYP2D6基因检测试剂盒，采用特异性PCR扩增引物组对含rs1801253位点的片段进行扩增，降低了扩增多个靶位点的可能性，提高了对rs1801253位点扩增的特异性和灵敏度，降低了假阳性率；同时，采用第二代高通量基因测序技术，使得对rs1801253位点的检测周期短，通量高。附图说明图1为第三实施例中文库分子的PAGE胶电泳图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。本专利技术提出第一实施例，一种CYP2D6基因检测试剂盒，包括用于对含rs1801253位点的核酸片段进行特异性扩增的引物组，所述引物组包括上游引物SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4，以及下游引物SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8。本方案提供的CYP2D6基因检测试剂盒，包括特异性扩增引物组，该特异性扩增引物组能够特异性扩增含rs1801253位点的核酸片段，降低了扩增非目的片段的可能性，从而使得对rs1801253位点检测的灵敏度高，假阳性率低。优选的，所述试剂盒还包括接头，所述接头包括接头A、接头B、接头C、接头D中的至少一种；所述接头A由SEQIDNO:9和SEQIDNO:10组成；所述接头B由SEQIDNO:11和SEQIDNO:12组成；所述接头C由SEQIDNO:13和SEQIDNO:14组成；所述接头D由SEQIDNO:15和SEQIDNO:16组成。其中，所述接头A上含有标签序列TTCC；所述接头B上含有标签序列GGTT；所述接头C上含有标签序列AAGG；所述接头D上含有标签序列CCAA。需要说明的是，当采用本专利技术的试剂盒对在同一体系中同时对不同样本的rs1801253位点进行检测时，由于在测序过程中使用的测序引物是相同的，因此需要采用含不同标签序列的接头分别连接不同的样本，通过对标签序列进行测序，无需对样本进行多次测序即可有效区分不同样本的测序结果。本方案设计的接头序列由于5’末端不含磷酸基团，不会发生自连，从而提高了接头与扩增产物之间的连接效率；且接头序列中组合的四种标签序列在后续检测过程中碱基识别简单，易于区分，且不会产生二级结构；标签序列长度为4bp，降低了设计和检测难度。优选的，所述SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15的5’末端上含有生物素标记，且生物素标记被预先固定在含链霉亲和素或亲和素的磁珠上。利用该生物素标记，可以在连接反应结束后，很方便的将含rs1801253位点和接头的核酸片段分离出来。优选的，所述试剂盒还包括测序引物，所述测序引物包括用于检测rs1801253位点的测序引物SEQIDNO:17。本方案设计的测序引物，在测序过程中连接在rs1801253位点附近区域，使得在测序过程中，仅需本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CYP2D6基因检测试剂盒，包括用于对含rs1801253位点的核酸片段进行特异性扩增的引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4，以及下游引物SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8。

【技术特征摘要】
2016.10.31 CN 20161092911431.一种CYP2D6基因检测试剂盒，包括用于对含rs1801253位点的核酸片段进行特异性扩增的引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4，以及下游引物SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8。2.根据权利要求1所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述基因检测试剂盒还包括接头，所述接头包括接头A、接头B、接头C、接头D中的至少一种；所述接头A由SEQIDNO:9和SEQIDNO:10组成；所述接头B由SEQIDNO:11和SEQIDNO:12组成；所述接头C由SEQIDNO:13和SEQIDNO:14组成；所述接头D由SEQIDNO:15和SEQIDNO:16组成。3.根据权利要求1所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述基因检测试剂盒还包括测序引物SEQIDNO:17，所述测序引物用于对含rs1801253位点的文库分子进行测序。4.根据权利要求3所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述测序引物的5’末端经过磷酸化修饰。5.一种基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A、利用扩增引物组，对含rs1801253位点的样本进行扩增，得扩增产物；其特征在于，所述引物组包括上游引物SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4，以及下游引物SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，高虹，
申请(专利权)人：广州康昕瑞基因健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44