本发明专利技术公开了一组用来筛查MPN相关基因突变的测序试剂盒以及后续的医学解读数据库。MPN相关基因群包括JAK2、CALR等17个基因。测序试剂盒包括对MPN相关17个基因全部外显子进行扩增的多重PCR引物。本发明专利技术提供的筛查MPN基因突变的试剂盒具有检测效率高、突变基因覆盖面广、检出率高等优点；给出的医学解读报告具有准确、权威的特点。
Detection kit for detecting MPN related gene groups
The present invention discloses a set of sequencing reagent kits for screening MPN related gene mutations and a subsequent medical interpretation database. MPN related genes, including JAK2, CALR and other 17 genes. Sequencing kits include multiplex PCR primers for amplification of all exons related to 17 MPN genes. The kit for screening MPN gene mutation provided by the invention has the advantages of high detection efficiency, wide coverage of mutant genes, high detection rate, etc. the medical interpretation report provided by the invention has the characteristics of accuracy and authority.
【技术实现步骤摘要】
一种检测MPN相关基因群的检测试剂盒
本专利技术涉及分子生物学
，进一步涉及筛查MPN相关基因突变的检测试剂盒及其医学解读数据库，具体涉及一种检测MPN相关基因群的检测试剂盒。
技术介绍
骨髓增殖性肿瘤(MPN)，是一类骨髓增生过多细胞而形成的疾病。此类疾病与骨髓增生异常综合征或急性骨髓性白血病有关或产生，而骨髓增生性疾病在与其他疾病相比有更良好预后。骨髓增殖性肿瘤是一种少见病，发生率0.02-2.8/10万人，最常见于60-70岁，诊断时年轻病例约20％。发病没有特点，一半患者诊断时无症状。其属于惰性肿瘤，WHO严格定义的ET生存期接近正常人，ET15年生存率80％，10年转化AML或MF风险小于1％，PV10年预计生存率大于75％，白血病转化与纤维化进展，分别小于5％和10％。主要并发症为血管事件(血栓形成和血管异常)目前检测MPN的方法主要涉及细胞形态、流式细胞学、细胞遗传学、分子生物学。其中分子生物学的实验方法主要有巢式PCR、一代测序等。PCR方法不能直观的得到具体的突变序列，而一代测序的方法受到测序通量的影响，无法一次性检测多个基因的全部外显子区域。而二代测序作为一种高通量的检测方法，可以一次性准确测量多个基因的外显子序列，使精准治疗成为可能。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种检测MPN相关基因群的检测试剂盒，以解决现有技术中MPN的诊断方法较为局限，缺乏从分子生物学的角度诊断MPN的依据。本专利技术要解决的另一技术问题是现有技术的MPN的诊断方法准确性较低。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种检测MPN相关基因群的检测试剂盒，该试剂盒包括以下17个基因：JAK2，CALR，CBL，TP53，SETBP1，NRAS，SF3B1，DNMT3A，ASXL1，TET2，PTPN11，KRAS，SRSF2，KIT，NPM1，MPL，FLT3。上述17个基因由28个热点突变组成，其突变位点为本领域常规的突变位点，较佳地包括了indel突变位点(插入或缺失引起的序列改变insertionordeletion，indel)、无义突变位点、拼接区突变位点或错义突变位点，更佳地本专利技术所述的17个基因外显子区域的热点突变如表1所示。表1热点突变列表突变基因突变位点突变基因突变位点突变基因突变位点JAK2p.V617FSETBP1p.D868NASXL1p.Y591XCALRp.L367fsSETBP1p.G870SPTPN11p.A72TCALRp.K385fsNRASp.Q61RKRASp.A146TCBLp.H398QNRASp.G12DSRSF2p.95_103delCBLp.F418LSF3B1p.L747WKITp.D816VCBLp.R420QSF3B1p.N626HNPM1p.W288fsTP53R248WDNMT3Ap.R882HMPLp.W515KTP53p.Y220CDNMT3Ap.R882CFLT3ITDTP53p.V173MTET2p.N1266STP53p.P151STET2p.P1962S本专利技术所述的17个基因外显子区域的热点突变可用于对MPN做出辅助诊断，本领域MPN常规的诊断方法有形态学、细胞遗传学和流式细胞学，本专利技术所述方法较佳地从分子生物学角度对MPN做出诊断。本专利技术提供一组检测本专利技术所述MPN相关基因外显子区域的多重PCR引物，所述引物的扩增范围包括17个与MPN相关基因的外显子区域，扩增得到的单个片段长度为250bp左右。利用本专利技术提供的多重PCR引物，结合二代测序技术，能够检测本专利技术所述突变基因群中的全部外显子区域。其中所述的二代测序试剂为本领域常规使用的试剂，只要能够满足对所得序列进行二代测序的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。本专利技术所述检测试剂盒更佳地还包括将检测对象中提取的基因组DNA制成可供测序使用的文库的试剂，该种试剂为本领域常规使用试剂，只要能够满足多重PCR对基因组DNA质量的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。本专利技术所述检测试剂盒较佳地还包括：dNTP溶液，DNA聚合酶，用于分离或纯化核酸的是Backman磁珠。本专利技术所述的样本为检测对象的组织，只要能从检测样本中抽提检测对象的基因组DNA即可。所述检测样本较佳地为骨髓、血液、实体瘤样本中的一种或几种，优选地为骨髓样本。一种本专利技术所述试剂盒的使用方法，其包括以下步骤：(1)利用本专利技术所述检测试剂盒抽提检测对象的骨髓，提取基因组DNA；(2)用多重PCR引物对基因组DNA中专利技术中所述17个MPN相关基因的外显子区域进行扩增；(3)将步骤(2)中扩增所得的片段制成可供IonTorrent测序平台测序的文库；(4)对步骤(3)中所得DNA文库进行测序，得到下机数据；(5)对(4)中的下机数据进行生物信息学分析，而后利用医学解读数据库进行解读做出诊断即可。以上各个步骤的具体操作方法详见试剂盒说明书。本专利技术所用的试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于：利用本专利技术提供的可用于筛查MPN相关基因突变的基因群，结合高通量测序技术，可以实现在形态学和流式细胞学之外对MPN进行辅助诊断，特别是对于疾病预后做出评估和针对相关靶药的作用效果做出预判具有特殊的优势。本专利技术提供的用于筛查MPN相关基因突变的基因群的检测试剂盒具有检测效率高、检出率高等优点。具体实施方式以下将对本专利技术的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。材料和方法：在中国医学科学院血液病医院和协和华美医学诊断中心2015年8月至2016年7月诊断的患者中，根据以下标准，我们进行连续性入组(63名)。入选标准为：经细胞形态学和流式细胞学诊断为骨髓增殖性肿瘤(MPN)的患者。63名患者的诊断结果如表2所示：表2患者诊断结果列表收集3mL患者骨髓提取基因组DNA待测，该检测经过中国医学科学院血液病医院伦理委员会批准。样本处理：样本中基因组利用天根DNA提取试剂盒(货号：DP318-03)进行抽提，具体操作方法参见试剂盒的使用说明书。用多重PCR引物对基因组DNA进行扩增，实验操作方法参见Life公司试剂盒的使用说明书。文库的构建：对扩增得到的DNA片段使用Life公司生产的IonTorrent平台建库试剂盒进行测序文库的构建，实验操作方法参见Life公司试剂盒的使用说明书。高通量测序：将构建好的测序文库经油包水处理后在IonTorrent平台上进行高通量测序，油包水处理方法和高通量测序方法请参考高通量测序仪IonTorrent以及其配套设备OneTouch的使用说明书。生物信息学分析：首先，使用IonReport软件(v4.6,ThermoFisher,Carlsbad,CA,USA)过滤低质量的测序片段，并将合格的测序片段比对到人类参考基因组hg19(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html)，使用TorrentVariantCaller(v4.6.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测MPN相关基因群的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括以下17个基因：JAK2，CALR，CBL，TP53，SETBP1，NRAS，SF3B1，DNMT3A，ASXL1，TET2，PTPN11，KRAS，SRSF2，KIT，NPM1，MPL，FLT3。
【技术特征摘要】
1.一种检测MPN相关基因群的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括以下17个基因：JAK2，CALR，CBL，TP53，SETBP1，NRAS，SF3B1，DNMT3A，ASXL1，TET2，PTPN11，KRAS，SRSF2，KIT，NPM1，MPL，FLT3。2.根据权利要求1所述的一种检测MPN相关基因群的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒还包括以上17个基因的引物，所述引物的扩增范围包括以上17个基因的全部外显子区域。3.根据权利要求2所述的一种检测MPN相关基因群的检测试剂盒，其特征在于所述外显子区域包括28个热点突变，所述28个热点突变及其与所述17个基因的对应关系如下表所示：4.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾玉娇，寇坤元，覃莉，陈龙，
申请(专利权)人：天津协和华美医学诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12
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