单管巢式PCR反应体系和扩增方法技术

本发明专利技术涉及基因工程及分子生物学领域，提供了一种单管巢式PCR反应体系，其包括双链DNA模板、外引物对和内引物对，所述外引物从5’端到3’端包括互补序列和靶区结合序列，所述靶区结合序列远离互补序列的末端与所述互补序列的碱基互补，所述外引物用于在第一退火温度下对变性解链的DNA模板扩增并获得中间产物，所述内引物用于在第二退火温度下对变性解链的中间产物扩增并获得目标产物，所述外引物在第二退火温度下形成引物双链结构。本发明专利技术还提供一种单管巢式PCR扩增方法，本发明专利技术的单管巢式PCR反应体系和扩增方法，保证了单管扩增后目标产物的纯度较高。

Single Tube Nested PCR Reaction System and Amplification Method

The present invention relates to the field of genetic engineering and molecular biology, and provides a single-tube nested PCR reaction system, which includes double-stranded DNA template, external primer pair and internal primer pair. The external primer includes complementary sequence and target binding sequence from 5'to 3'. The target binding sequence is far from the end of complementary sequence and base complementation of the complementary sequence. The internal primer is used to amplify the intermediate product of the denatured chain at the second annealing temperature and obtain the target product. The external primer forms a primer double-chain structure at the second annealing temperature. The invention also provides a single tube nested PCR amplification method. The single tube nested PCR reaction system and amplification method of the invention ensure that the purity of the target product after single tube amplification is high.

【技术实现步骤摘要】
单管巢式PCR反应体系和扩增方法
本专利技术涉及基因工程及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种单管巢式PCR扩增方法。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)是用于扩增DNA链的特定区域的技术。DNA链可以是单个基因、基因的仅仅一部分或非编码序列。大部分PCR方法通常扩增多达10k碱基对(kilobasepair，kb)的DNA片段，但一些技术允许扩增大小达40kb的片段(Cheng等，1994，ProcNatlAcadSci.91：5695-5699)。现有技术为提高PCR扩增特异性提供了一种巢式PCR扩增方法。巢式PCR扩增反应在两个接连的反应中使用两组不同引物。在一扩反应中，使用第一引物对靶标区域DNA片段进行一阶段PCR扩增产生中间产物，该中间产物可能还含有从非靶标区域扩增的产物。然后将中间产物用于起始二扩反应，所述二扩反应使用第二引物对靶标区域DNA片段进行二阶段PCR扩增产生目标产物。通常，第二引物对的结合位点位于第一引物对以内。巢式PCR通常在一个试管中进行一扩反应，然后将中间产物的等分试样转移到第二试管中进行二扩反应。现有技术巢式PCR扩增方法的中间产物在两个试管之间移转本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单管巢式PCR反应体系，其特征在于：反应体系中包括双链DNA模板、外引物对和内引物对，所述外引物从5’端到3’端包括互补序列和靶区结合序列，所述靶区结合序列远离互补序列的末端与所述互补序列的碱基互补，所述外引物用于在第一退火温度下对变性解链的DNA模板扩增并获得中间产物，所述内引物用于在第二退火温度下对变性解链的中间产物扩增并获得目标产物，所述外引物在第二退火温度下形成引物双链结构。

【技术特征摘要】
1.一种单管巢式PCR反应体系，其特征在于：反应体系中包括双链DNA模板、外引物对和内引物对，所述外引物从5’端到3’端包括互补序列和靶区结合序列，所述靶区结合序列远离互补序列的末端与所述互补序列的碱基互补，所述外引物用于在第一退火温度下对变性解链的DNA模板扩增并获得中间产物，所述内引物用于在第二退火温度下对变性解链的中间产物扩增并获得目标产物，所述外引物在第二退火温度下形成引物双链结构。2.根据权利要求1所述的单管巢式PCR反应体系，其特征在于：所述引物双链结构包括引物发卡结构或引物二聚体结构。3.根据权利要求2所述的单管巢式PCR反应体系，其特征在于：所述外引物对包括第一外引物和第二外引物，所述引物双链结构为第一外引物和第二外引物之间形成的双链结构。4.根据权利要求2所述的单管巢式PCR反应体系，其特征在于：所述外引物对包括第一外引物和第二外引物，所述引物发卡结构包括第一外引物或第二外引物自身形成的双链结构。5.根据权利要求1所述的单管巢式PCR反应体系，其特征在于：所述第一退火温度的范围是65-72℃，所述第二退火温度的范围是50-62℃。6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，黄思强，
申请(专利权)人：广州康昕瑞基因健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44