均相检测EGFR基因21外显子突变指数的方法技术

本发明专利技术涉及均相检测EGFR基因21外显子突变指数的方法，适用于荧光偏振检测技术，分别检测阴性对照标准品、阳性对照标准品及待测样品EGFR等位基因21外显子目的基因的最终扩增产物的FAM和R110荧光偏振值，根据检测值计算待测样品的EGFR等位基因21外显子突变指数。本发明专利技术创造性地提出了EGFR等位基因21外显子突变指数及对EGFR等位基因21外显子突变指数进行检测的方法，也就是对基因组中EGFR等位基因21外显子变异型与野生型的比例即相对数量水平进行检测的方法，EGFR等位基因21外显子突变指数是较EGFR等位基因21外显子变异型绝对数量与药物反应性更高度相关、更敏感特异的分子标识，检测EGFR等位基因21外显子突变指数是较仅检测变异型别和绝对数量更科学准确、标准量化、更有预测价值的检测。

Homogeneous detection of the 21 exon mutation index of EGFR gene

The present invention relates to the method of detecting the mutation index of the EGFR gene 21 exon, which is suitable for the fluorescence polarization detection technique to detect the FAM and R110 fluorescence polarization values of the final amplification products of the negative control standard, the positive control standard and the EGFR allele of the samples to be measured, and the value of the fluorescence polarization is calculated according to the detection value. The EGFR allele 21 exon mutation index of the sample. The invention creatively proposed the method of detecting the mutation index of the EGFR allele 21 exon and the detection of the 21 exon mutation index of the EGFR allele, that is, the method for detecting the proportion of the EGFR allele 21 exon variant and the wild type in the genome, the EGFR allele 21 exon mutation The index is a more highly correlated and more sensitive and specific molecular marker of the absolute number of the 21 exons of the EGFR allele and the drug reactivity. The detection of the 21 exon mutation index of the EGFR allele is more scientific and accurate, the standard quantification and the more predictive value more than the only detection of the variant and absolute number.

【技术实现步骤摘要】
均相检测EGFR基因21外显子突变指数的方法
本专利技术涉及EGFR等位基因21外显子突变指数检测
，具体涉及一种均相检测EGFR基因21外显子突变指数的方法。
技术介绍
等位基因变异是细胞中一对同源染色体双链DNA相同位置上控制某性状基因的变异。个体基因组中，等位基因变异与野生型同时存在，相互制约平衡，共同影响基因表达和功能，影响生物反应，决定细胞转归性质等表型；个体内等位基因变异存在异质性和剂量效应，不同个体在不同阶段等位基因变异与野生型的相对数量水平不同，变异相对数量水平变化直接影响基因功能和表达。EGFR等位基因21外显子变异与野生型同时存在，互相影响，共同决定细胞EGFR靶向药物反应性表型。不同个体EGFR等位基因21外显子L858R、L861Q的突变含量差异较大，我们将基因组中EGFR等位基因21外显子变异型与野生型的比例即相对数量水平命名为EGFR等位基因21外显子突变指数，它是个体较EGFR等位基因21外显子变异型别和绝对数量与药物反应性更高度相关、更敏感特异、更科学准确、标准量化的的分子标识。故个体中EGFR等位基因21外显子野生型与突变型相对含量：EGFR等位基因21外显子突变指数是更全面的EGFR靶向药药效预测指标。但目前现有技术或只检测EGFR等位基因21外显子突变或只检测其绝对量，而未检测EGFR等位基因21外显子野生型与突变型的相对含量比例，因检测对象片面，检测结果受取材基因变异异质性、取材方法、数量部位等因素影响，应用价值低；或检测方法繁琐低效、不标准化。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种均相检测EGFR基因21外显子突变指数的方法，适用于荧光偏振检测技术，用于EGFR等位基因21外显子突变指数即EGFR等位基因21外显子野生型与突变型含量比值的检测，克服现有技术存在的片面、成本高、操作步骤繁琐、易污染的问题。本专利技术具有以下优点：本专利技术创造性地提出了EGFR等位基因21外显子突变指数的概念及对EGFR等位基因21外显子突变指数进行荧光偏振均相检测的方法，也就是对基因组中EGFR等位基因21外显子基因变异型与野生型的比例即相对数量水平进行检测的方法。该检测EGFR等位基因21外显子突变指数方法是较EGFR等位基因21外显子变异绝对数量检测与EGFR靶向药药物反应性更高度相关、更敏感特异、更科学准确、标准量化、更有预测价值的分子标识检测方法。与现有技术相比，本专利技术的优点是：1、EGFR等位基因21外显子突变指数的概念更科学准确。2、本方法步骤简单，操作简单：样本中EGFR等位基因21外显子野生型与突变型相对含量检测闭管中一步进行，不易发生污染,结果准确。3、结果分析简单：EGFR等位基因21外显子突变指数判断时仅需EGFR等位基因21外显子野生型与突变型荧光偏振检测数字计算比较，易标准化、自动化；4、成本低：荧光偏振均相检测。不需任何专用试剂及荧光淬灭或微沟槽结合剂，不需实时检测。5、应用范围广：可用于检测细胞、血液或组织标本。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细的说明。本专利技术涉及的均相检测EGFR基因21外显子突变指数的方法，适用于荧光偏振检测技术。所用试剂包括：MgCl2，10×PCR反应缓冲液，dNTPs，EGFR等位基因21外显子DNA引物，EGFR等位基因21外显子L858R、L861Q突变DNA的FAM标记探针、EGFR等位基因21外显子L858R、L861Q野生型DNA的R110标记探针，模板：待检测样品DNA，阴性对照标准品（pGEM-T-easy空载体）、阳性对照标准品（EGFR等位基因21外显子野生型对照标准品与21外显子突变型对照标准品的混合物，浓度均为大于1000拷贝/ml）。对试剂分别进行扩增，然后对扩增产物分别进行FAM和R110荧光偏振值的检测，阳性对照标准品FAM和R110荧光偏振值分别大于阴性对照标准品FAM和R110荧光偏振值30mp以上则为扩增成功，根据待检测样品FAM和R110荧光偏振值与阳、阴性对照标准品的差值高低变化和比值判读待检测样品的EGFR等位基因21外显子突变指数。待测样品的EGFR等位基因21外显子突变指数=｛〔待测样品的FAM荧光偏振值-（阳性对照标准品FAM荧光偏振值-阴性对照标准品FAM荧光偏振值）〕／（阳性对照标准品FAM荧光偏振值-阴性对照标准品FAM荧光偏振值）｝÷｛〔待测样品的R110荧光偏振值-（阳性对照标准品R110荧光偏振值-阴性对照标准品R110荧光偏振值）〕／（阳性对照标准品R110荧光偏振值-阴性对照标准品R110荧光偏振值）｝。扩增反应在25uL体系中进行，加入10×PCR反应缓冲液2.5µL，浓度均为2.0mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，DNA聚合酶1-2单位，2.5mMMgCL2。0.5uM的EGFR21外显子正向引物，0.05uM的EGFR21外显子反向引物，0.5uM的EGFR21外显子R110标记野生型探针、EGFR21外显子FAM标记突变型探针,模板5uL。根据EGFR等位基因GenBank序列(AY588246)，设计合成覆含EGFR等位基因21外显子的引物及外显子野生型、突变型探针：EGFR21正向引物：5'-accgtacttgtactgggactt-3'；EGFR21反向引物5'-ctgtggtccctggtccgac-3'。21外显子野生型特异茎环形探针：Probe21wild：5’cgcctggccaaactgctgggcg-R1103’；21外显子突变型特异茎环形探针：Probe21mutation：5’cgcgcg(t)ggccaaact(a)gctgggcg-FAM3’。阴性对照反应中加阴性对照标准品5uL（pGEM-T-easy载体10000拷贝/ml），阳性对照反应中加阳性对照标准品5uL（含EGFR等位基因21外显子野生基因产物pGEM-T-wild-21克隆1000拷贝/ml和含EGFR等位基因21外显子变异基因产物pGEM-T-L858Rmutation-21克隆1000拷贝/ml）。待测1/1混合样品：将阴性对照标准品（pGEM-T-wild-21，10000拷贝/ml）和阳性对照标准品（pGEM-T-L858Rmutation-21，10000拷贝/ml)按1/1拷贝比例混合，提取DNA，5uL加入扩增反应。待测2/1混合样品：将阴性对照标准品（pGEM-T-wild-21，10000拷贝/ml）和阳性对照标准品（pGEM-T-L858Rmutation-21，10000拷贝/ml)按2/1拷贝比例混合，取DNA，5uL加入扩增反应。对试剂进行扩增,扩增反应条件为：94℃变性5min后，95°C孵育10秒，55°C孵育10秒，72°C孵育20秒，45个循环，最后一个循环无72°C孵育。检测扩增反应终末产物FAM、R110荧光偏振值FP，检测结果：根据以上FAM和R110荧光偏振值的高低变化结果和比值得到待测混合样品的EGFR等位基因21外显子突变指数：待测1/1混合样品EGFR21外显子突变指数=｛〔133－（88-45）〕／（88－45）｝÷｛〔119－（79－40）〕／（79－40）｝≈1待测2/1本文档来自技高网...

【技术保护点】
均相检测EGFR基因21外显子突变指数的方法，其特征在于：适用于荧光偏振检测技术，分别检测阴性对照标准品、阳性对照标准品及待测样品EGFR等位基因21外显子目的基因的最终扩增产物的FAM和R110荧光偏振值，根据检测值计算待测样品的EGFR等位基因21外显子突变指数。

【技术特征摘要】
1.均相检测EGFR基因21外显子突变指数的方法，其特征在于：适用于荧光偏振检测技术，分别检测阴性对照标准品、阳性对照标准品及待测样品EGFR等位基因21外显子目的基因的最终扩增产物的FAM和R110荧光偏振值，根据检测值计算待测样品的EGFR等位基因21外显子突变指数。2.根据权利要求1所述的均相检测EGFR基因21外显子突变指数的方法，其特征在于：待测样品的EGFR等位基因21外显子突变指数=｛〔待测样品的FAM荧光偏振值-（阳性对照标准品FAM荧光偏振值-阴性对照标准品FAM荧光偏振值）〕／（阳性对照标准品FAM荧光偏振值-阴性对照标准品FAM荧光偏振值）｝÷｛〔待测样品的R110荧光偏振值-（阳性对照标准品R110荧光偏振值-阴性对照标准品R110荧光偏振值）〕／（阳性对照标准品R110荧光偏振值-阴性对照标准品R110荧光偏振值）｝。3.根据权利要求1所述的均相检测EGFR基因21外显子突变指数的方法，其特征在于：所用试剂包括：MgCl2，10×PCR反应缓冲液，dNTPs，EGFR等位基因21外显子DNA引物，EGFR等位基因21外显子L858R、L861Q突变DNA的FAM标记探针，EGFR等位基因21外显子L858R、L861Q野生型DNA的R110标记探针；模板：待检测样品DNA，阴性对照标准品、阳性对照标准品；阴性对照标准品为pGEM-T-easy空载体，阳性对照标准品为EGFR等位基因21外显子野生型对照标准品与21外显子突变型对照标准品的混合物，浓度均为大于1000拷贝/ml。4.根据权利要求3所述的均相检测EGFR基因21外显子突变指数的方法，其特征在于：对试剂分别进行扩增，然后对扩增产物...

【专利技术属性】
技术研发人员：张菊，张潍，王晓栋，王金燕，姜英浩，刘文超，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61