一种用于检测EGFR TKI敏感突变的引物和探针制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测EGFR TKI敏感突变的引物和探针。本发明专利技术的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～13和SEQ ID NO:16～17所示；本发明专利技术的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:14～15和SEQ ID NO：18所示。本发明专利技术的有益效果在于：检测时删减了突变率非常低的突变类型，在保证了其他ARMS PCR技术优点的情况下，减少了实验所需的总时间，减少了实验的成本，设计位点仍然覆盖EGFR TKI敏感突变的90％以上。另外，通过全新的设计19外显子缺失突变和L858R突变的检测引物和探针，能都得到较好的检出效率。

A primer and probe for detecting EGFR TKI sensitive mutation

The present invention discloses a primer and probe for detecting EGFR TKI sensitive mutation. The nucleotide sequences of the primers are shown as SEQ ID NO:1-13 and SEQ ID NO:16-17, and the nucleotide sequences of the probes are shown as SEQ ID NO:14-15 and SEQ ID NO:18. The invention has the advantages that the mutation type with very low mutation rate is deleted during detection, the total time required for the experiment is reduced, the cost of the experiment is reduced, and the design site still covers more than 90% of the EGFR TKI sensitive mutation while ensuring the advantages of other ARMS PCR techniques. In addition, the new design of 19 exon deletion mutation and L858R mutation detection primers and probes can be better detection efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测EGFRTKI敏感突变的引物和探针
本专利技术涉及生物技术和医学
，具体涉及一种用于检测EGFRTKI敏感突变的引物和探针。
技术介绍
表皮生长因子受体EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor)属于表皮生长因子受体家族(HER)，在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR锚定在细胞膜上发挥生物学效应，由膜内和膜外两部分组成。膜外部分主要起到接收信号的作用，膜内部分主要通过络氨酸激酶(tyrosinekinase,TK)起向下传导信号的作用。EGFR在肿瘤的发生发展中起到至关重要重要的作用，依次设计出了针对EGFR-TK的靶向抑制剂(EGFR-TKinhibitor,EGFR-TKI)，阻断肿瘤细胞的信号传导，从而达到抑制肿瘤细胞的增殖、转移、血管生成等，促进肿瘤细胞的凋亡。但是，并不是所有肿瘤细胞对EGFR-TKI都有反应，只有当EGFR基因18-21外显子发生EGFR-TKI敏感突变时，EGFR-TKI才会发挥较好的肿瘤抑制作用，这类突变占整个东亚人群的～45％。19外显子缺失突变和21外显子L858R突变占所有EGFR-TKI敏感突变的90％以上。当肿瘤细胞不携带EGFR-TKI敏感突变时，EGFR-TKI类药物的有效率将低至10％。因此，在临床实践中，检测EGFR-TKI敏感突变，对于治疗方案的选取具有重要意义。目前针对EGFR-TKI敏感突变的常见检测方法包括：Sanger测序法、ARMSPCR、数字PCR、第二代测序法等。对于Sanger测序法来说，灵明度～1％，整个实验完成需要2-3天的时间，主要针对组织样本。目前，虽然Sanger测序法是组织EGFR-TKI敏感突变检测的金标准，但是缺点也是十分明显的，灵敏度较低，整个实验周期较长。另外对于血液样本来说，Sanger测序法比较困难。数字PCR具有高灵敏度的特点，可以达到0.1％。但是数字PCR也有较为严重的缺点，设备价格较高、稳定性不佳、对实验环境要求较高等。另外数字PCR整体上来讲，检测价格也远高于Sanger测序法和ARMSPCR。因此，目前数字PCR对于EGFR-TKI敏感突变的检测也仅仅停留在对T790M突变的检测项目上。第二代测序技术具有高通量、高灵敏性的特点，与此同时也带来了高成、高耗时、高复杂的缺点。因此，第二代测序在实际中也并不适合于EGFR-TKI敏感突变的检测。当前，最有效检测EGFR-TKI敏感突变的方法仍然是ARMSPCR。ARMSPCR全名为突变组织扩增系统PCR(amplificationrefractorymutationsystemPCR)，灵敏度高达0.1％，样品来源包括组织和血液，并且成本与SangerPCR一样较低，整个检测实验周期不超过一天。目前，现有的EGFR-TKI敏感突变ARMSPCR检测试剂盒通常包括18外显子、19外显子、20外显子和21外显子上20个以上突变位点的检测。但是，从临床大数据分析来看，其中90％以上的突变集中在19外显子缺失突变和21外显子L858R突变。并且对于没有经过EGFR-TKI治疗的患者来说T790M和20外显子插入耐药突变的发生率非常低。虽然，目前针对EGFR-TKI灵敏突变的检测可以包括多种基因部位的突变检测，但是其中大部分都是低概率发生的突变，无形之中增加了检测成本，由此可能会加重病人的治疗负担。
技术实现思路
为了克服现有检测方法成本较高的缺点，本专利技术针对19外显子缺失突变和21外显子L858R突变设计新型的引物和探针，通过优化使EGFR-TKI敏感突变检测灵敏度保持在90％以上的前提下，减少其他不必要的检测位点，降低检测成本，使更多患者受益。本专利技术的技术方案具体如下：本专利技术提供一种用于检测EGFRTKI敏感突变的引物，其包括用于检测19外显子缺失突变的上游引物E19F以及下游引物E19R-1、E19R-2、E19R-3、E19R-4、E19R-5、E19R-6、E19R-7、E19R-8和E19R-9，用于检测21外显子L858R突变的上游引物L858RF-1、L858RF-2和下游引物L858RR，以及外控上游引物、外控下游引物；其中：上游引物E19F的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，下游引物E19R-1、E19R-2、E19R-3、E19R-4、E19R-5、E19R-6、E19R-7、E19R-8和E19R-9的核苷酸序列分别如SEQIDNO:2～10所示；上游引物L858RF-1、L858RF-2的核苷酸序列如SEQIDNO:12～13所示，下游引物L858RR的核苷酸序列如SEQIDNO:11所示，外控上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示，外控下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：17所示。本专利技术还提供一种用于检测EGFRTKI敏感突变的探针，其包括核苷酸序列如SEQIDNO:14所示的用于检测19外显子缺失突变的探针，核苷酸序列如SEQIDNO:15所示的用于检测21外显子L858R突变的探针，以及核苷酸序列如SEQIDNO:18所示的外控探针。本专利技术中，探针的5’端设有荧光基团FAM，3’设有淬灭基团BHQ1。本专利技术还提供一种用于检测EGFRTKI敏感突变的试剂盒，其包括上述引物和探针。与现有ARMSPCR检测EGFRTKI敏感突变技术对比，本专利技术主要有益效果在于，检测时删减了突变率非常低的突变类型，在保证了其他ARMSPCR技术优点的情况下，减少了实验所需的总时间，减少了实验的成本，设计位点仍然覆盖EGFRTKI敏感突变的90％以上。另外，通过全新的设计19外显子缺失突变和L858R突变的检测引物和探针，能都得到较好的检出效率。附图说明图1为各个突变位点最低检测限。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术的技术方案进行详细阐述。本专利技术根据19外显子缺失常见的10种突变(E746-A750del(Ⅰ)；E746-T750delI；E746-T751delA；E746-S752delV；E746-A750del(Ⅱ)；L747-T751del；L747-S752del；L747-A750delP；L747-P753delS；L747-T751delP)和21外显子L858R突变的特点，设计了相应的引物和探针，引物和探针如表1所示。表1引物与探针本专利技术中还包括一种用于检测EGFRTKI敏感突变19外显子缺失突变和21外显子L858R突变的试剂盒，其中包括了上述的引物和探针，还包括了含有Taq酶、dNTP、10×buffer和MgCl2的PCR反应液。PCR反应体系如表2所示。10×buffer配方如表3所示。表2一份PCR反应液原料加入量10×buffer2.5μl25mMMgCl23μlTaq酶0.25μl模板2μl25mMdNTPs2.5μl上游引物0.25μl下游引物0.25μl探针0.25μlddH2O将总体积补至25μl表310×buffer(总体积1毫升)原料加入量1MTris100μl1MKCl500μlTritonX-10010μlTE390μl具体实验步骤：1、首先取三个PCR反应管，分别用于检测19外显子缺失突变(管1)、L858R突变(管2)和EGFRTK外本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测EGFR TKI敏感突变的引物，其特征在于，其包括用于检测19外显子缺失突变的上游引物E19F以及下游引物E19R‑1、E19R‑2、E19R‑3、E19R‑4、E19R‑5、E19R‑6、E19R‑7、E19R‑8和E19R‑9，用于检测21外显子L858R突变的上游引物L858RF‑1、L858RF‑2和下游引物L858RR，以及外控上游引物、外控下游引物；其中：上游引物E19F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物E19R‑1、E19R‑2、E19R‑3、E19R‑4、E19R‑5、E19R‑6、E19R‑7、E19R‑8和E19R‑9的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2～10所示；上游引物L858RF‑1、L858RF‑2的核苷酸序列如SEQ ID NO:12～13所示，下游引物L858RR的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，外控上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示，外控下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测EGFRTKI敏感突变的引物，其特征在于，其包括用于检测19外显子缺失突变的上游引物E19F以及下游引物E19R-1、E19R-2、E19R-3、E19R-4、E19R-5、E19R-6、E19R-7、E19R-8和E19R-9，用于检测21外显子L858R突变的上游引物L858RF-1、L858RF-2和下游引物L858RR，以及外控上游引物、外控下游引物；其中：上游引物E19F的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，下游引物E19R-1、E19R-2、E19R-3、E19R-4、E19R-5、E19R-6、E19R-7、E19R-8和E19R-9的核苷酸序列分别如SEQIDNO:2～10所示；...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷豪志，张群，祝琳，王煜蘅，
申请(专利权)人：上海浦美生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31