同步检测基因突变和甲基化的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及同步检测基因突变和甲基化的方法及其应用。揭示了一种优化的复合扩增方法，采用不同的引物/探针组，在两个反应体系中，同时扩增重亚硫酸盐转化后的DNA，实现对基因突变和甲基化的同步检测，从而有效提高基因检测的效率。

【技术实现步骤摘要】
同步检测基因突变和甲基化的方法及其应用
本专利技术属于突变检测领域，更具体地，本专利技术创立了一种同步检测基因突变和甲基化的方法及其应用。
技术介绍
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)在1985年由美国KaryBMullis教授专利技术，该技术采用一对寡核苷酸引物，通过变性、退火、延伸三个循环步骤，可使目标DNA片段呈指数扩增，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力。PCR技术是一个极其灵敏的信号放大系统，能将极微弱的基因信号检测出来。将PCR扩增技术和荧光探针技术相结合，开发出了多种多样的荧光PCR检测方法，目前在医学、微生物学、遗传学等领域广泛使用。DNA分子中发生碱基对的插入、缺失或替换，而引起的基因结构的改变，称为基因突变。通过检测样品中是否存在某些核酸序列变异，可以判断检测对象是否携带突变基因、患有某种疾病或处于某种遗传状态。基因突变检测技术已经广泛应用于生命科学的众多领域，包括病原微生物的鉴定、分型和耐药性检测，肿瘤患者的药效预测，疾病诊断与预后等。DNA甲基化是最重要的基因表观修饰方式之一。DNA甲基化能抑制某些基因的活性，去甲基化则可以诱导基因的重新活化和表达。哺乳动物中，DNA的甲基化仅发生于CpG的胞嘧啶上，在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸中的胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶(mC)。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它可以调控基因的表达。DNA甲基化在维持正常细胞功能、染色质结构修饰、X染色体失活、基因组印迹、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。在肿瘤细胞中，基因突变和甲基化修饰都是较为常见的现象。特定基因的突变和甲基化对于肿瘤患者的分型、预后判断、用药指导等方面都有重要的参考价值。比如：KRAS基因突变的大肠癌患者不能从抗EGFR治疗中获益，EGFR基因突变的肺癌患者使用吉非替尼和厄洛替尼治疗的效果较好，BRAF基因突变的大肠癌患者和甲状腺癌患者一般预后较差，MGMT基因发生甲基化的脑胶质瘤患者可以选择替莫唑胺进行术后化疗，MLH1基因发生甲基化的大肠癌患者可以排除遗传性大肠癌的可能性。对于基因突变的检测，通常采用基因组DNA作为模板，直接进行PCR扩增。而对于甲基化的检测，应用最为广泛的是重亚硫酸盐转化法。该方法采用重亚硫酸钠(Na2S2O5)处理样本DNA，将没有发生甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，而发生甲基化的胞嘧啶(mC)保持不变；转化产物经过PCR扩增后，U转变为T，而mC转变为C，从而将基因组上的甲基化和非甲基化的差异转变成为C/T碱基的多态性，通过检测目标位点上的C/T碱基状态，就可以确定是否存在基因的甲基化。突变检测直接扩增基因组DNA，甲基化检测扩增重亚硫酸盐转化后的DNA。因为扩增的DNA模板不同，所以针对这两种不同类型的基因检测，一般是在不同反应体系中进行的。而在同一个反应体系中同步进行基因突变和甲基化检测的方法还未见报道和应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供同步检测基因突变和甲基化的方法及其应用。在本专利技术的第一方面，提供一种同步检测待测样本中基因突变和甲基化修饰的方法，所述方法包括：(1)对待测样本进行重亚硫酸盐处理，使未发生甲基化修饰的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)；(2)设置反应体系a，以步骤(1)处理后样本为模板，加入特异性检测基因突变的引物和探针、甲基化修饰检测区段的通用引物和探针；设置反应体系b，以步骤(1)处理后样本为模板，加入特异性检测甲基化修饰的引物和探针、基因突变区段的通用引物和探针；(3)反应体系a和反应体系b分别进行PCR反应，确定相关的基因突变和甲基化修饰的存在与否或存在量。在另一优选例中，所述的方法是非诊断、非治疗性的方法。在另一优选例中，述的基因突变包括：位于核酸上的碱基替换、缺失或插入；或所述的甲基化修饰包括：CpG位点甲基化修饰。在另一优选例中，所述的特异性检测基因突变的引物和探针，仅扩增和检测发生基因突变的核酸区段；所述的特异性检测甲基化修饰的引物和探针，仅扩增和检测发生甲基化修饰的核酸区段；所述的基因突变区段的通用引物和探针，同时扩增和检测突变型和野生型核酸区段；所述的甲基化修饰检测区段的通用引物和探针，同时扩增和检测发生甲基化修饰和未发生甲基化修饰的核酸区段。在另一优选例中，所述的特异性检测基因突变的探针与所述的基因突变区段的通用探针为同一探针，所述的特异性检测基因突变的引物中，包括一条针对基因突变位点的引物及一条非针对突变位点的引物；较佳地，突变检测通用引物的其一与该针对基因突变位点的引物序列相近，但不包含突变位点，突变检测通用引物的另一与该非针对突变位点的引物相同；或所述的特异性检测甲基化修饰的引物与甲基化修饰检测区段的通用引物相同，但特异性检测甲基化修饰的探针与甲基化修饰检测区段的通用探针不同(前者针对甲基化修饰待测位点，后者针对非甲基化修饰待测位点)。在另一优选例中，所述的特异性检测基因突变的引物与所述的基因突变区段的通用引物相同，所述的特异性检测基因突变的探针与所述的基因突变区段的通用探针不同(前者针对突变位点，后者针对非突变位点)；或所述的特异性检测甲基化修饰的探针与甲基化修饰检测区段的通用探针为同一探针，所述的特异性检测甲基化修饰的引物中，包括一条针对甲基化修饰的引物及一条非针对甲基化修饰的引物；较佳地，甲基化修饰检测区段的通用引物的其一与该针对甲基化修饰的引物序列相近，但不包含CpG位点，甲基化修饰检测区段通用引物的另一与该非针甲基化修饰的引物相同。在另一优选例中，反应体系a中，所述的特异性检测基因突变的探针与所述的甲基化修饰检测区段的通用探针，携带不同的报告信号；反应体系b中，所述的特异性检测甲基化修饰的探针与所述的基因突变区段的通用探针，携带不同的报告信号；在另一优选例中，所述的特异性检测基因突变的探针与所述的基因突变区段的通用探针，携带相同的报告信号；所述的特异性检测甲基化修饰的探针与所述的甲基化检测区段的通用探针，携带相同的报告信号；从而对所述基因突变和所述甲基化修饰进行同步检测；较佳地，所述的报告信号为荧光基团。在另一优选例中，同步检测待测样本中1～5种基因突变，和/或1～5种甲基化修饰。在本专利技术的另一方面，提供一种用于同步检测待测样本中基因突变和甲基化修饰的试剂盒，所述试剂盒中包括：特异性检测基因突变的引物和探针；甲基化修饰检测区段的通用引物和探针；特异性检测甲基化修饰的引物和探针；基因突变区段的通用引物和探针；其中，所述的基因突变为BRAF基因突变；所述的甲基化修饰为MLH1基因的甲基化修饰。在另一优选例中，所述的BRAF基因为其15外显子的1799核苷酸上T→A的突变，导致其编码的缬氨酸由谷氨酸取代(V600E)。在另一优选例中，所述的MLH1基因的甲基化修饰为其启动子区(转录起始位点前-231、-229和-223位点)上发生的甲基化修饰。在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：使未发生甲基化修饰的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)的试剂，较佳地为重亚硫酸盐；PCR扩增试剂(包括但不限于PCR缓冲液，DNA聚合酶，MgCl2或dNTPs)；和/或使用说明书。在另一优选例中，所述的特异性检测基因突变的引物为SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同步检测待测样本中基因突变和甲基化修饰的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)对待测样本进行重亚硫酸盐处理，使未发生甲基化修饰的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)；(2)设置反应体系a，以步骤(1)处理后样本为模板，加入特异性检测基因突变的引物和探针、甲基化修饰检测区段的通用引物和探针；设置反应体系b，以步骤(1)处理后样本为模板，加入特异性检测甲基化修饰的引物和探针、基因突变区段的通用引物和探针；(3)反应体系a和反应体系b分别进行PCR反应，确定相关的基因突变和甲基化修饰的存在与否或存在量。

【技术特征摘要】
1.一种同步检测待测样本中基因突变和甲基化修饰的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)对待测样本进行重亚硫酸盐处理，使未发生甲基化修饰的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)；(2)设置反应体系a，以步骤(1)处理后样本为模板，加入特异性检测基因突变的引物和探针、甲基化修饰检测区段的通用引物和探针；设置反应体系b，以步骤(1)处理后样本为模板，加入特异性检测甲基化修饰的引物和探针、基因突变区段的通用引物和探针；(3)反应体系a和反应体系b分别进行PCR反应，确定相关的基因突变和甲基化修饰的存在与否或存在量。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因突变包括：位于核酸上的碱基替换、缺失或插入；或所述的甲基化修饰包括：CpG位点甲基化修饰。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的特异性检测基因突变的引物和探针，仅扩增和检测发生基因突变的核酸区段；所述的特异性检测甲基化修饰的引物和探针，仅扩增和检测发生甲基化修饰的核酸区段；所述的基因突变区段的通用引物和探针，同时扩增和检测突变型和野生型核酸区段；所述的甲基化修饰检测区段的通用引物和探针，同时扩增和检测发生甲基化修饰和未发生甲基化修饰的核酸区段。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的特异性检测基因突变的探针与所述的基因突变区段的通用探针为同一探针，所述的特异性检测基因突变的引物中，包括一条针对基因突变位点的引物及一条非针对突变位点的引物；较佳地，突变检测通用引物的其一与该针对基因突变位点的引物序列相近，但不包含突变位点，突变检测通用引物的另一与该非针对突变位点的引物相同；或所述的特异性检测甲基化修饰的引物与甲基化修饰检测区段的通用引物相同，但特异性检测甲基化修饰的探针与甲基化修饰检测区段的通用探针不同(前者针对甲基化修饰待测位点，后者针对非甲基化修饰待测位点)。5.如权利要求1所述的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王东，李宾，钮琪，赵静，张涛，
申请(专利权)人：基因科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31