一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法，它包括以下步骤：1）获得遗传背景一致的无性系组培植株并移栽；2）通过盆栽控水/营养获得遗传背景一致的黑果枸杞无刺和有刺型；3）提取有刺和无刺黑果枸杞叶片总DNA；4）对提取的总DNA进行双酶切并连接接头；5）对酶切连接产物进行PCR预扩增；6）对预扩增产物进行选择性PCR扩增；7）选择性PCR扩增产物的毛细管电泳；8）筛选无刺节叶片特异性MSAP位点；9）特异性条带的回收、测序和分析；本发明专利技术筛选出的黑果枸杞棘刺相关MSAP位点稳定，为培育黑果枸杞无刺品种、调控黑果枸杞株型和产量打下基础；可以丰富植物抗旱理论、植物表型可塑性理论。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法
本专利技术属于植物表观遗传学领域，具体涉及一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法。
技术介绍
黑果枸杞（LyciumruthenicumMurr.）为茄科枸杞属多年生多棘刺灌木。野生黑果枸杞常以灌丛状生于盐碱荒地、盐化沙地、盐湖岸边、路旁等各种盐渍化土壤或荒漠环境，具有防风固沙和改善土质的作用。并且黑果枸杞果实保健价值和价格远超普通红果枸杞。黑果枸杞是用于治理和开发利用沙化土地及盐碱地的优良生态经济型树种。因此，荒漠和沙化土地营造黑果枸杞经济防护林具有重要的社会、经济和生态意义。但是黑果枸杞坚硬且牢固的棘刺不但增加造林和日常管理（尤其是采果）难度，而且降低了人工林的经济效益。棘刺表型是采果类经济树种的重要性状之一。参照无刺沙棘的生产表现，我们发现同等条件下的无刺类型无疑更宜作经济型林木栽培。综上，培育优良无刺黑果枸杞是一个很值得研究的课题。有研究通过盆栽控水处理联合浇灌营养液的方法成功抑制了黑果枸杞组培无性系产生棘刺。相同遗传背景的组培无性系，在不同的水分营养条件下，可以产生或者完全不产生棘刺，这属于环境影响发育的典型实例。在前期研究的基础之上，本专利技术筛选出稳定的黑果枸杞棘刺相关MSAP（甲基化敏感的扩增片段长度多态性）位点。对位点相关基因的进一步研究可为阐明黑果枸杞棘刺发育机理奠定基础，为培育黑果枸杞无刺品种、调控黑果枸杞株型和产量打下基础，为培育其它木本植物的无刺类型提供借鉴。此外，本专利技术可以丰富植物抗旱理论、植物表型可塑性理论、填补国内外茎刺相关研究的空缺。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种有效且低成本的筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法。一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法，它包括以下步骤：1）获得遗传背景一致的无性系组培植株并移栽；2）通过盆栽控水/营养获得遗传背景一致的黑果枸杞无刺和有刺型；3）提取有刺和无刺黑果枸杞叶片总DNA；4）对提取的总DNA进行双酶切并连接接头；5）对酶切连接产物进行PCR预扩增；6）对预扩增产物进行选择性PCR扩增；7）选择性PCR扩增产物的毛细管电泳；8）筛选无刺节叶片特异性MSAP位点；9）特异性条带的回收、测序和分析；步骤4）中所述的双酶切，反应体系为：反应体系1（EcoRⅠ与HpaⅡ双酶切体系）：BSA（10mg/L）1μLH/Madaptor（25μM）1μLEcoRⅠadaptor（2.5μM）1μLEcoRⅠ（20U/μL）0.15μLHpaⅡ（10U/μL）0.3μLDNA150ng加去离子水补足到总反应体积为20μL；反应体系2（EcoRⅠ与MspⅠ双酶切体系）：BSA（10mg/L）1μLH/Madaptor（25μM）1μLEcoRⅠadaptor（2.5μM）1μLEcoRⅠ（20U/μL）0.15μLMspⅠ（20U/μL）0.15μLDNA150ng加去离子水补足到总反应体积为20μL；将混匀的体系，在37℃进行DNA酶切5-6h之后，每个反应体系添加T4ligase0.1μL，混匀后在8℃下进行接头连接4h；步骤4）中所述的双链接头，是先把两个单链的接头复性为双链结构，EcoRⅠ接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至5μM后等量混合；H/M接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至50μM后等量混合；后将混合接头煮沸5min，冷却后得到；步骤5）中PCR预扩增反应体系为：10×PCRreactionbuffer2.5μldNTPs（10mM）0.5μlEcoRⅠadaptor+A（5μM）1μlH/Madaptor+0（5μM）1μlTaqDNApolymerase（5U/μl）0.2μlPCRwater17.8μlDNA模板（酶切连接产物稀释20倍后）2μlTotalvolume25μl；反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃复性30S，72℃延伸60S，共进行30个循环，最后72℃延伸10min；用0.1×TEbuffer稀释预扩增产物5-20倍；步骤6）中选择性PCR扩增反应体系为：10×PCRreactionbuffer1.5μldNTPs（2.5mM）0.15μlEcoRⅠprimer（5μM）0.6μlH/Mprimer（5μM）0.6μlTaqDNApolymerase（5U/μl)0.2μlPCRwater9.95μlDNA模板（预扩增稀释产物）2μlTotalvolume15μl；混匀体系，反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30S，65℃复性30S，72℃延伸80S，以后每轮循环温度递减1℃，扩增10轮。接着95℃变性30S，56℃复性30S，72℃延伸80S，共进行30个循环，最后72℃延伸10min；步骤6）所述的选择性PCR扩增，引物对如下：EcoRⅠ引物5’端分别用F6-羧基荧光素（FAM）、6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素琥珀酰亚胺（HEX）或TAMARA等进行标记。本专利技术提供了一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法，它包括以下步骤：1）获得遗传背景一致的无性系组培植株并移栽；2）通过盆栽控水/营养获得遗传背景一致的黑果枸杞无刺和有刺型；3）提取有刺和无刺黑果枸杞叶片总DNA；4）对提取的总DNA进行双酶切并连接接头；5）对酶切连接产物进行PCR预扩增；6）对预扩增产物进行选择性PCR扩增；7）选择性PCR扩增产物的毛细管电泳；8）筛选无刺节叶片特异性MSAP位点；9）特异性条带的回收、测序和分析；本专利技术筛选出的黑果枸杞棘刺相关MSAP位点稳定，为培育黑果枸杞无刺品种、调控黑果枸杞株型和产量打下基础；可以丰富植物抗旱理论、植物表型可塑性理论。附图说明图1筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点流程图。具体实施方式下面将结合实际操作对本专利技术作进一步说明，但本专利技术的内容并不局限于以下的实施例。实施例1一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法1.获得无菌种苗将黑果枸杞成熟种子置于37℃温水中处理24小时；在无菌超净工作台中用70-75%酒精浸泡种子30S-1min，迅速将种子置于0.2%的氯化汞水溶液中浸泡2min；无菌水冲洗4遍后，将种子表面的水吸干并横向平接在不添加任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养基（添加0.45%的琼脂和2%的蔗糖，pH值用1M的KOH调为5.8，121℃高压灭菌16min），注意种子和培养基一定要紧密接触。将接种的材料置于25℃、“光照12h/黑暗12h”光周期条件下培养，光照为3000lx。2.接种茎外植体获得再生植株待上步接种的种子萌发并长出20片以上真叶时，于超净工作台将茎剪为1-2节的小段，接种到添加6-BA0.2mg·L-1的MS固体培养基（蔗糖3.5%；琼脂0.45%；pH5.6；121℃高压灭菌16min）。将其置于“光照12h/黑暗12h”的光周期条件下培养，培养温度为25℃；此条件下茎段外植体插入培养基一端产生结节样愈伤后形成不定芽，茎段外植体叶腋处产生丛生芽。待芽长至2-4cm高时，将其剪下插入不含任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养基（添加0.45%的琼脂和2%的蔗糖，pH值用1M的KOH调为5.8,121℃高压灭菌16min）诱导生根。3.壮苗、移栽驯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法，它包括以下步骤：1）获得遗传背景一致的无性系组培植株并移栽；2）通过盆栽控水/营养获得遗传背景一致的黑果枸杞无刺和有刺型；3）提取有刺和无刺黑果枸杞叶片总DNA；4）对提取的总DNA进行双酶切并连接接头；5）对酶切连接产物进行PCR预扩增；6）对预扩增产物进行选择性PCR扩增；7）选择性PCR扩增产物的毛细管电泳；8）筛选无刺节叶片特异性MSAP位点；9）特异性条带的回收、测序和分析。

【技术特征摘要】
1.一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法，它包括以下步骤：1）获得遗传背景一致的无性系组培植株并移栽；2）通过盆栽控水/营养获得遗传背景一致的黑果枸杞无刺和有刺型；3）提取有刺和无刺黑果枸杞叶片总DNA；4）对提取的总DNA进行双酶切并连接接头；5）对酶切连接产物进行PCR预扩增；6）对预扩增产物进行选择性PCR扩增；7）选择性PCR扩增产物的毛细管电泳；8）筛选无刺节叶片特异性MSAP位点；9）特异性条带的回收、测序和分析。2.根据权利要求1所述的一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法，其特征在于：步骤4）中所述的双酶切，反应体系为：反应体系1（EcoRⅠ与HpaⅡ双酶切体系）：BSA（10mg/L）1μLH/Madaptor（25μM）1μLEcoRⅠadaptor（2.5μM）1μLEcoRⅠ（20U/μL）0.15μLHpaⅡ（10U/μL）0.3μLDNA150ng加去离子水补足到总反应体积为20μL；反应体系2（EcoRⅠ与MspⅠ双酶切体系）：BSA（10mg/L）1μLH/Madaptor（25μM）1μLEcoRⅠadaptor（2.5μM）1μLEcoRⅠ（20U/μL）0.15μLMspⅠ（20U/μL）0.15μLDNA150ng加去离子水补足到总反应体积为20μL；将混匀的体系，在37℃进行DNA酶切5-6h之后，每个反应体系添加T4ligase0.1μL，混匀后在8℃下进行接头连接4h。3.根据权利要求2所述的一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法，其特征在于：步骤4）中所述的双链接头，是先把两个单链的接头复性为双链结构，EcoRⅠ接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至5μM后等量混合；H/M接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至50μM后等量混合；后将混合接头煮沸5min，冷却后得到。4.根据权利要求3所述的一种筛选黑果枸杞棘刺相关MSAP位点的方法，其特征在于：步骤5）中PCR预扩增反应体系为：10×PCRreactionbuffer2.5μldNTPs（10mM）0.5μlEcoRⅠadaptor+A（5μM）1μlH/Madaptor+0（5μM）1μlTaqDNApolymerase（5U/...

【专利技术属性】
技术研发人员：王钦美，王皓，周永斌，秦胜金，崔建国，林梅，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21