本发明专利技术提供的用于HLA基因扩增、基因分型的引物组、试剂盒和方法，属于基因检测领域。所述的用于HLA基因扩增的引物组，分别根据HLA‑A基因的8个外显子区、HLA‑B基因的8个外显子区和HLA‑DRB1基因的外显子2和外显子3设计引物，利用所述引物对所述HLA基因进行PCR扩增，得到基因片段长度大于400bp，小于1.5kb的产物；通过上述引物PCR扩增HLA基因，使得扩增产物的基因片段长度大于400bp，小于1.5kb，对模板的完整性要求降低，扩增效率高，扩增反应时间短，成本降低，可以满足大规模样本HLA基因的扩增或基因分型的需求。
【技术实现步骤摘要】
一种HLA基因扩增、基因分型的引物组、试剂盒和方法
本专利技术属于基因检测领域，具体涉及一种基于二代测序技术的HLA基因扩增、基因分型的引物组、试剂盒和方法。
技术介绍
人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen，简称HLA)，编码基因位于6号染色体短臂上，全长约4000Kb，是目前所知人类最复杂的遗传多态性系统，与人类的免疫系统功能密切相关。HLA又被称为移植抗原，是决定移植排斥反应高低的重要因素。在进行器官移植时，供者和受者之间HLA相容程度越高，排斥反应的发生率就越低，移植成功率和移植器官患者长期存活率就越高；反之，就越容易发生排斥反应。因此，对HLA进行高效准确的分型对器官移植至关重要。HLA基因分成三类：I类、II类和III类基因。其中，I类包括：HLA-A、HLA-B、HLA-C基因；II类包括：HLA-DRB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1基因。HLA系统是目前所知人体最复杂的多态系统。自1958年发现(JeanDausset)第一个HLA抗原，到20世纪70年代，HLA便成为免疫遗传学、免疫生物学和生物化学等学科的一个重要新兴研究领域。现在，已基本弄清其系统的组成、结构和功能，闸明了其理化性质和生物学作用。这些研究成果不仅具有重要的理论意义，而且具有巨大的生物医学价值。随着医学的发展，像白血病、地中海贫血等能用最新的基因技术进行分型检测，再寻找合适的供体进行移植治疗。目前通过HLA高分辨分型的外周血干细胞移植技术能大大提高配型效果，使患者的康复更快，更有保征。HLA分型方法包括血清学分型法、细胞学分型法以及分子生物学分型法。随着分子生物学技术的飞速发展，传统的血清学和细胞学分型方法已逐步被分子生物学分型方法所取代。现阶段，HLA分子分型方法主要有：多聚酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)，多聚酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)，多聚酶链反应-序列特异性寡核苷酸反应(PCR-SSOP)，基因芯片和测序分型(PCR-SBT)等。PCR-SSP需要设计出一整套基因特异性引物，通过PCR技术获得特异性产物，通过电泳分析决定HLA基因型别。其缺点不易、不能检测新的等位基因；试剂盒需不断升级；检测的信号也只说模拟的信号，不直观可靠。PCR-SSOP的原理：设计HLA基因型别特异的寡核苷酸序列作为探针，对PCR产物进行标记，以PCR产物与探针进行杂交。通过检测信号判断HLA基因型别。但该方法的缺点是不能检测新的等位基因，分辨率不高，检测信号为模拟信号。SBT法是一种通过对扩增后的DNA进行一代测序，从而判断HLA基因型别的方法。该方法是一种最直观、最准确的方法，可广泛用于HLA基因的高分辨分型检测，但是该方法对扩增过程的引物序列要求很高，引物序列直接关系到整个型别的确定，一对好的特异性引物是该方法成功的关键。因此，为改变目前落后的HLA基因分型方法，需研发一种更加有效，且在检测通量、数据质量、成本控制等方面，更有优势的方法。以Illumina和IonTorrent为代表的第二代测序技术(NGS)基于边合成边测序的原理，与传统一代测序相比，具有样品制备简单、低成本、高通量、结果更准确等优势。将二代测序技术应用于HLA分型，将大大降低检测成本，简化操作步骤，使测序结果直观，能获得高分辨分型数据，还能得到新基因型等位基因序列和等位基因的单倍体序列。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种HLA(人类白细胞抗原)基因特异性PCR扩增引物及利用该引物进行HLA分型的方法和试剂盒。本专利技术提供的一种基于二代测序技术的HLA基因扩增、高分辨分型的引物组、试剂盒和方法的HLA分型方法能大大提高配型效果，使患者的治疗更有依据。由于该方法应用二代测序技术，只需通过一次实验就能够确定HLA分型，并一次性达到HLA分型的最高分辨率，同时，还可发现新的等位基因，在检测通量、数据质量、成本控制等方面都有质的飞跃。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用于HLA基因扩增的引物组，分别根据HLA-A基因的8个外显子区、HLA-B基因的8个外显子区和HLA-DRB1基因的外显子2和外显子3设计引物，利用所述引物对所述HLA基因进行PCR扩增，得到基因片段长度大于400bp，小于1.5kb的产物。所述的用于HLA基因扩增的引物组，所述引物的核苷酸序列如下(1)-(4)中的任意一种：(1)序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO19所示：或(2)为(1)中所述的序列中的至少一个序列的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列；或(3)为(1)中所述的序列中的至少一个序列的5’端和/或3’端减少小于或等于3个核苷酸的序列；或(4)为(1)中所述的序列中的至少一个序列的中部增加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列。其中，所述SEQIDNO.1-SEQIDNO.5所示的引物序列用于扩增HLA-A基因的引物序列；SEQIDNO.1-SEQIDNO.2用于PCR扩增HLA-A基因的第1个外显子至第3个外显子，扩增的HLA-A基因片段长度为1.1kb；SEQIDNO.3-5用于PCR扩增HLA-A基因的外显子4-8，扩增HLA-A基因片段长度为1.4kb。所述SEQIDNO.6-SEQIDNO.9所示的引物序列是用于扩增HLA-B基因的引物序列；引物序列SEQIDNO.6-SEQIDNO.7用于PCR扩增HLA-B基因第1个外显子至第3个外显子，扩增的HLA-B基因片段长度为1.2kb；引物序列SEQIDNO.8-SEQIDNO.9用于PCR扩增HLA-B基因第4个外显子至第8个外显子，扩增HLA-B基因片段长度为1.4kb。所述SEQIDNO.10-SEQIDNO.19所示的引物序列是用于扩增HLA-DRB1基因的引物序列；引物SEQIDNO.10-SEQIDNO.17用于PCR扩增HLA-DRB1基因的外显子2，扩增HLA-DRB1基因片段长度为400-800bp；引物SEQIDNO.18-SEQIDNO.19用于PCR扩增HLA-DRB1基因的外显子3，扩增HLA-DRB1基因片段长度为400-1000bp。优选的，所述的用于HLA基因扩增的引物组，上述增加、减少和/或取代的核苷酸选自A、T、C或G。本专利技术提供了一种用于HLA基因扩增的试剂盒，包括所述的用于HLA基因扩增的引物组。所述用于HLA基因扩增的试剂盒，包括HLA-A基因扩增的PCR反应体系，以20μL为计，如下：2×PCRbuffer，10μl；A-F1，5μM，0.8μlA-R1，5μM，0.8μlA-F2-1，5μM，1μlA-F2-2，5μM，1μlA-R2，5μM，1μlDNA模板，20-50ng/μl，2μlTaq酶，5U/μL，0.15μl余量用纯水补足。所述用于HLA基因扩增的试剂盒，还包括HLA-B基因扩增的PCR反应体系，以20μL为计，如下：2×PCRbuffer，10μl；引物B-F1，5μM，0.8μl；引物B-R1，5μM，0.8μl；引物B-F2，5μM，0.8μl；引物B-R2，5μM，0.8μl；DNA模板，20-50ng/μl，2μl；Taq酶，5本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于HLA基因扩增的引物组，其特征在于，分别根据HLA‑A基因的8个外显子区、HLA‑B基因的8个外显子区和HLA‑DRB1基因的外显子2和外显子3设计引物，利用所述引物对所述HLA基因进行PCR扩增，得到基因片段长度大于400bp，小于1.5kb的产物。
【技术特征摘要】
1.一种用于HLA基因扩增的引物组，其特征在于，分别根据HLA-A基因的8个外显子区、HLA-B基因的8个外显子区和HLA-DRB1基因的外显子2和外显子3设计引物，利用所述引物对所述HLA基因进行PCR扩增，得到基因片段长度大于400bp，小于1.5kb的产物。2.根据权利要求1所述的用于HLA基因扩增的引物组，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下(1)-(4)中的任意一种：(1)序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO19所示：或(2)为(1)中所述的序列中的至少一个序列的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列；或(3)为(1)中所述的序列中的至少一个序列的5’端和/或3’端减少小于或等于3个核苷酸的序列；或(4)为(1)中所述的序列中的至少一个序列的中部增加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列。3.一种用于HLA基因扩增的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的用于HLA基因扩增的引物组。4.根据权利要求3所述的用于HLA基因扩增的试剂盒，其特征在于，包括HLA-A基因扩增的PCR反应体系以20μL为计，如下：2×PCRbuffer，10μl；A-F1，5μM，0.8μlA-R1，5μM，0.8μlA-F2-1，5μM，1μlA-F2-2，5μM，1μlA-R2，5μM，1μlDNA模板，20-50ng/μl，2μlTaq酶，5U/μL，0.15μl余量用纯水补足。5.根据权利要求3或4所述的用于HLA基因扩增的试剂盒，其特征在于，包括HLA-B基因扩增的PCR反应体系，以20μL为计，如下：2×PCRbuffer，10μl；引物B-F1，5μM，0.8μl；引物B-R1，5μM，0.8μl；引物B-F2，5μM，0.8μl；引物B-R2，5μM，0.8μl；DNA模板，20-50ng/μl，2μl；Taq酶，5U/μL，0.15μl；余量用纯水补足至20μL。6.根据权利要求3-5任一项所述的用于HLA基因扩增的试剂盒，其特征在于，包括HLA-DRB1基因扩增的PCR反应体系，以20μL为计，如下：2×PCRbuffe...
【专利技术属性】
技术研发人员：康颖，
申请(专利权)人：北京诺诗康瀛基因技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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