一种检测CYP3A4、CYP3A5多态性位点的试剂盒及其方法技术

本发明专利技术公开了一种检测CYP3A4、CYP3A5多态性位点的试剂盒及其方法，包含序列表中序列1‑4所示CYP3A4*1G的特异性上下游引物序列、序列5‑8所示CYP3A4*1G的特异性TaqMan‑MGB双荧光探针序列、序列9‑12所示CYP3A5*3的特异性上下游引物序列和序列13‑16所示CYP3A5*3的特异性TaqMan‑MGB双荧光探针序列。本发明专利技术的有益效果为特异性强、防污染、灵敏度高、检测速度快、结果分析简单且准确性高、该试剂盒可以通过检测CYP3A4、CYP3A5基因多态性位点，判断待测对象对芬太尼类药物的代谢能力，从而更准确有效地指导芬太尼类等药物的用药，具有实际的临床应用价值。将该试剂盒应用于临床的诊断后，与现有技术的吻合度更高，且价格低廉、可重复性高。

A kit for detecting CYP3A4 and CYP3A5 polymorphic loci and its method

The present invention discloses a kit for detecting CYP3A4 and CYP3A5 polymorphism loci and its method. The kit comprises a specific upstream and downstream primer sequence of CYP3A4*1G shown in sequence 1_4, a specific TaqMan_MGB double fluorescent probe sequence shown in sequence 5_8, and a specific upstream and downstream primer sequence of CYP3A5*3 shown in sequence 9_12. TaqMan and MGB double fluorescence probes of CYP3A5*3 are shown in column 13 and sequence 16. The invention has the advantages of strong specificity, anti-pollution, high sensitivity, fast detection speed, simple and accurate result analysis, and the kit can judge the metabolic ability of the tested object to fentanyl drugs by detecting the polymorphic loci of CYP3A4 and CYP3A5 genes, so as to guide fentanyl drugs more accurately and effectively. The use of drugs is of practical clinical value. After the kit is applied to clinical diagnosis, it has a higher coincidence with the prior art, and is low in price and high in repeatability.

【技术实现步骤摘要】
一种检测CYP3A4、CYP3A5多态性位点的试剂盒及其方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及基因检测，更具体地涉及CYP3A4、CYP3A5多态性位点基因检测试剂盒及其方法。
技术介绍
CYP3A4是CYP3A亚家族中最主要的成员,占P450酶系总量的30%~40%,主要分布在肝脏和肠道。它参与了许多药物和外源性毒物的氧化代谢,可代谢约50%的临床常用药物。研究表明,人肝脏中CYP3A4的表达及其活性存在着明显的个体差异,并且这种差异90%与遗传多态性有关。CYP3A4基因位于人类第7号染色体7q21.1-q22.1上，长约27kbp，其基因结构包括13个外显子及12个内含子。CYP3A4*1G（20230G>A）是CYP3A4内含子10中的一个单核苷酸多态性（SNP），其在中国汉族人群中的发生频率为22.1%～37%。CYP3A4*1G与阿托伐他汀、环孢霉素、他克莫司、芬太尼等药物的剂量、疗效及药代动力学改变有关。CYP3A5位于人类7号染色体q21.1-q22.1，基因全长为31.8kb，有13个外显子，编码502个氨基酸。CYP3A5占CYP3A总量的50%，主要在肝和小肠及其他肝外组织如肾、前列腺和肺中表达，CYP3A5表达和活性呈高度多态性，有广泛个体与种族差异。CYP3A5酶的氨基酸与编码CYP3A4酶的氨基酸有84%的相似性，CYP3A5酶和CYP3A4酶具有诸多重叠的代谢底物和相似的催化活性，但CYP3A5酶活性比CYP3A4低80%。其中位于内含子3的SNP(6986A>G突变)最为重要，突变定义为CYP3A5*3，在中国人群中的发生频率较高（71%~77.8%）。芬太尼类药物为人工合成的强效麻醉性镇痛药，镇痛机制与吗啡相似，为阿片受体激动剂，作用强度为吗啡的60-80倍。其主要通过肝脏细胞色素酶P450系统的CYP3A4/CYP3A5亚家族代谢，药物在体内的代谢速率受酶活影响。芬太尼类药物为临床主要的麻醉用药，但药物剂量一旦过量，会导致呼吸抑制甚至死亡的危险。通过检测芬太尼类药物的主要代谢基因CYP3A4/CYP3A5的基因位点，来判断患者对芬太尼类药物的代谢能力，从而指导药物的使用剂量。目前很多药物通过P450家族的酶代谢，测定P450基因型，确定酶活很关键。但是CYP3A4、CYP3A5基因的几个关键位点，由于序列结构比较特殊，设计荧光探针的难度较大，且设计出来的探针对基因型的分别率不高，同时与之匹配的PCR引物要求也高，引物本身或上下游引物之间存在二级结构，或引物与DNA模板的结合效率低，上下游引物之间的DNA模板序列存在高GC等特殊结构，都将导致PCR效率低。目前市场上销售的分型产品，只有全球最大的生物公司ThermalFisher提供，其序列与配方全部保密，且试剂盒价格昂贵。目前国内一般采用直接测序法和定性PCR法来检测基因多态性。这两种方法的灵敏度和特异性均不高，并不能准确的检测出基因多态性。此外，直接测序大部分采用外包实验，检测时间太长，至少需要24小时，为检测带来不便。综上所述，本领域迫切需要开发操作简便、特异性好、准确率高、能高效地检测CYP3A4、CYP3A5多态性位点的试剂盒和方法，以弥补国内CYP3A4、CYP3A5基因检测方面的不足。
技术实现思路
本专利技术者通过广泛而深入的研究，进行大量筛选，找到了适合CYP3A4*1G、CYP3A5*3基因检测的特异性引物和特异性TaqMan-MGB双荧光探针，具体地提供了针对CYP3A4*1G基因和CYP3A5*3基因的上、下游引物和特异性荧光探针，制成用于检测CYP3A4、CYP3A5基因多态性位点的实时荧光PCR检测试剂盒。本专利技术提供的用于检测CYP3A4、CYP3A5多态性位点的试剂盒包含序列表中序列1-4所示CYP3A4*1G的特异性引物上下游序列、序列5-8所示CYP3A4*1G的特异性TaqMan-MGB双荧光探针序列、序列9-12所示CYP3A5*3的特异性引物上下游序列和序列13-16所示CYP3A5*3的特异性TaqMan-MGB双荧光探针序列；2×MasterMix及使用说明书。一种检测CYP3A4、CYP3A5多态性位点的试剂盒，该试剂盒包括引物，特异性TaqMan双荧光探针和PCR扩增试剂，其中检测试剂盒分成两组：A组用于检测位点CYP3A4*1G的引物序列：SEQ1：5'CAGAGCCTTCCTACATAGAG3'；SEQ2：5'GGCCCAATCAATTATCTTTA3'；用于检测位点CYP3A4*1G的探针序列：SEQ3：5'FAM-TCTCCATGTACCATCCACTC-3'MGB；SEQ4：5'VIC-TCTCCATGTATCATCCACTC-3'MGB；用于检测位点CYP3A5*3的引物序列：SEQ5：5'AGAGTGGCATAGGAGATACC3'；SEQ6：5'GTGTGACACACAGCAAGAGT3'；用于检测位点CYP3A5*3的探针序列：SEQ7：5'FAM-TTGTCTTTCAATATCTCTTCCC-3'MGB；SEQ8：5'VIC-TTGTCTTTCAGTATCTCTTCCC-3'MGB；B组用于检测位点CYP3A4*1G的引物序列：SEQ9：5'CTTACGCTTCTGCCAGTAG3'；SEQ10：5'TATGTATGAACTGGCCACTC3'；用于检测位点CYP3A4*1G的探针序列：SEQ11：5'FAM-CTCCATGTACCATCCACT-3'MGB；SEQ12：5'VIC-CTCCATGTATCATCCACT-3'MGB；用于检测位点CYP3A5*3的引物序列：SEQ13：5'GAGAGTGGCATAGGAGATAC3'；SEQ14：5'AAGCCAGACTTTGATCATTA3'；用于检测位点CYP3A5*3的探针序列：SEQ15：5'FAM-TGTCTTTCAATATCTCTTCCC-3'MGB；SEQ16：5'VIC-TGTCTTTCAGTATCTCTTCCC-3'MGB；所述特异性TaqMan双荧光探针分为特异性野生型TaqMan荧光探针和特异性突变型TaqMan荧光探针，其5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有淬灭基团；所述特异性野生型TaqMan荧光探针和所述特异性突变型TaqMan荧光探针的荧光报告基团肯定是不同的，淬灭基团可相同可不同。所述荧光报告基团可选自下组的报告基团：FAM、VIC、TET、JOE、HEX；所述淬灭基团可选自下组的淬灭基团：BHQ1、BHQ2、TAMRA、MGB。优选的，本专利技术所述的特异性野生型TaqMan荧光探针的荧光报告基团为FAM，淬灭基团为MGB；所述特异性突变型TaqMan荧光探针的荧光报告基团为VIC，淬灭基团为MGB。所述PCR扩增试剂包含PCR缓冲液dATP、dCTP、dGTP、dUTP、dTTP、UDG酶、Taq酶和ddH2O。本专利技术试剂盒可用于CYP3A4、CYP3A5多态性位点的检测，检测方法包括如下步骤：使用基因组提取方法提取待测样本的基因组DNA，浓度为10-100ng/μL，所述待测样本选自：血液样本、唾液样本、口腔拭子、或其组合；配制浓度为5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测CYP3A4、CYP3A5多态性位点的试剂盒，该试剂盒包括引物，特异性TaqMan双荧光探针和PCR扩增试剂，其中检测试剂盒分成两组：A组用于检测位点CYP3A4*1G的引物序列：SEQ1：5' CAGAGCCTTCCTACATAGAG 3'；SEQ2：5' GGCCCAATCAATTATCTTTA 3'；用于检测位点CYP3A4*1G的探针序列：SEQ3：5'FAM‑TCTCCATGTACCATCCACTC‑3' MGB；SEQ4：5' VIC‑TCTCCATGTATCATCCACTC‑3' MGB；用于检测位点CYP3A5*3的引物序列：SEQ5：5' AGAGTGGCATAGGAGATACC 3'；SEQ6：5' GTGTGACACACAGCAAGAGT 3'；用于检测位点CYP3A5*3的探针序列：SEQ7：5' FAM‑TTGTCTTTCAATATCTCTTCCC‑3' MGB；SEQ8：5' VIC‑TTGTCTTTCAGTATCTCTTCCC‑3' MGB；B组用于检测位点CYP3A4*1G的引物序列：SEQ9：5' CTTACGCTTCTGCCAGTAG 3'；SEQ10：5' TATGTATGAACTGGCCACTC 3'；用于检测位点CYP3A4*1G的探针序列：SEQ11：5' FAM‑CTCCATGTACCATCCACT‑3' MGB；SEQ12：5' VIC‑CTCCATGTATCATCCACT‑3' MGB；用于检测位点CYP3A5*3的引物序列：SEQ13：5' GAGAGTGGCATAGGAGATAC 3'；SEQ14：5' AAGCCAGACTTTGATCATTA 3'；用于检测位点CYP3A5*3的探针序列：SEQ15：5' FAM‑TGTCTTTCAATATCTCTTCCC‑3' MGB；SEQ16：5' VIC‑TGTCTTTCAGTATCTCTTCCC‑3' MGB；所述特异性TaqMan双荧光探针分为特异性野生型TaqMan荧光探针和特异性突变型TaqMan荧光探针，其5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有淬灭基团；所述特异性野生型TaqMan荧光探针和所述特异性突变型TaqMan荧光探针的荧光报告基团肯定是不同的，淬灭基团可相同可不同；所述荧光报告基团可选自下组的报告基团：FAM、VIC、TET、JOE、HEX；所述淬灭基团可选自下组的淬灭基团：BHQ1、BHQ2、TAMRA、MGB；所述特异性野生型TaqMan荧光探针的荧光报告基团为FAM，淬灭基团为MGB；所述特异性突变型TaqMan荧光探针的荧光报告基团为VIC，淬灭基团为MGB；CYP3A4、CYP3A5多态性位点试剂盒的检测是在判断待测对象对芬太尼类药物的代谢能力上的应用。...

【技术特征摘要】
1.一种检测CYP3A4、CYP3A5多态性位点的试剂盒，该试剂盒包括引物，特异性TaqMan双荧光探针和PCR扩增试剂，其中检测试剂盒分成两组：A组用于检测位点CYP3A4*1G的引物序列：SEQ1：5'CAGAGCCTTCCTACATAGAG3'；SEQ2：5'GGCCCAATCAATTATCTTTA3'；用于检测位点CYP3A4*1G的探针序列：SEQ3：5'FAM-TCTCCATGTACCATCCACTC-3'MGB；SEQ4：5'VIC-TCTCCATGTATCATCCACTC-3'MGB；用于检测位点CYP3A5*3的引物序列：SEQ5：5'AGAGTGGCATAGGAGATACC3'；SEQ6：5'GTGTGACACACAGCAAGAGT3'；用于检测位点CYP3A5*3的探针序列：SEQ7：5'FAM-TTGTCTTTCAATATCTCTTCCC-3'MGB；SEQ8：5'VIC-TTGTCTTTCAGTATCTCTTCCC-3'MGB；B组用于检测位点CYP3A4*1G的引物序列：SEQ9：5'CTTACGCTTCTGCCAGTAG3'；SEQ10：5'TATGTATGAACTGGCCACTC3'；用于检测位点CYP3A4*1G的探针序列：SEQ11：5'FAM-CTCCATGTACCATCCACT-3'MGB；SEQ12：5'VIC-CTCCATGTATCATCCACT-3'MGB；用于检测位点CYP3A5*3的引物序列：SEQ13：5'GAGAGTGGCATAGGAGATAC3'；SEQ14：5'AAGCCAGACTTTGATCATTA3'；用于检测位点CYP3A5*3的探针序列：SEQ15：5'FAM-TGTCTTTCAATATCTCTTCCC-3'MGB；SEQ16：5'VIC-TGTCTTTCAGTATCTCTTCCC-3'MGB；所述特异性TaqMan双荧光探针分为...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐荣，苏丽，吴丹，
申请(专利权)人：默禾医疗科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31