一种获取日本鳗鲡高密度SNP分子标记的方法技术

本发明专利技术公开了一种获取日本鳗鲡高密度SNP分子标记的方法，包括提取基因组DNA，DNA模板的制备，高通量测序。有益效果为：本发明专利技术克服了标记数目的匮乏对日本鳗鲡群体遗传结构精确分析的限制，且获取效率高，无需纯化步骤，降低了DNA片段的损失和浪费，减少了获取成本；所采用的酶切体系中内切酶稳定性好，不易失活，且所获得的DNA片段纯度高，为后续步骤提供了充足的DNA片段。

A method for obtaining high density SNP molecular markers in Japanese eel

The present invention discloses a method for obtaining high density SNP molecular markers of Japanese eel, including the extraction of genomic DNA, the preparation of DNA templates, and high throughput sequencing. The beneficial effect of the invention overcomes the accurate analysis of the genetic structure of the Japanese eel population lack marker number of constraints, and obtain high efficiency, without purification steps, reduces DNA fragment losses and waste, reduce the cost of acquisition; the restriction enzyme system has good stability, easy deactivation, DNA fragment of purity and obtained high, provides sufficient DNA fragments for subsequent steps.

【技术实现步骤摘要】
一种获取日本鳗鲡高密度SNP分子标记的方法
本专利技术涉及分子生物
，尤其是涉及一种获取日本鳗鲡高密度SNP分子标记的方法。
技术介绍
日本鳗鲡（Anguillajaponica）是一种具有重要经济价值的降海产卵洄游性鱼类，广泛分布于中国、日本以及韩国。其生活史非常复杂，生长阶段经历了柳叶鳗、玻璃鳗、黄鳗、银鳗等阶段。由于近几十年来的人为影响及全球气候变化等，造成了其野生资源数量锐减，目前已处于濒危状态。尽管日本鳗鲡的分布范围非常广泛，几乎占据了整个亚洲东部沿海，但是其只存在马里亚纳群岛附近一个产卵场，所以一直以来被认为是一个随机交配物种的典型代表。然而，关于日本鳗鲡是否应作为单一的随机交配群体进行管理与保护是长期存在争议的科学难题。在以往的有关日本鳗鲡群体遗传学研究当中，由于标记数目的限制，往往不能够全面精确分析和揭示日本鳗鲡的群体遗传结构，所获结果并不一致，甚至互相矛盾。为合理保护与管理日本鳗鲡这一珍贵的海洋生物资源，非常有必要进一步开发更多广泛均匀分布于基因组水平上的遗传标记，开展日本鳗鲡的遗传多样性现状、种群遗传结构等方面的系统研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种获取日本鳗鲡高密度SNP分子标记的方法，该方法克服了标记数目的匮乏对日本鳗鲡群体遗传结构精确分析的限制，且获取效率高，无需纯化步骤，降低了DNA片段的损失和浪费，减少了获取成本。本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案为：一种获取日本鳗鲡高密度SNP分子标记的方法，包括以下步骤：提取基因组DNA：采用酚/氯仿抽提法从日本鳗鲡肌肉或鳍条组织中提取基因组DNA；DNA模板的制备：采用限制性内切酶EcoRI对基因组DNA进行酶切，向酶切片段中加入第一接头，将所得DNA片段混池，打断，通过琼脂糖凝胶电泳回收200bp-400bp的DNA片段，末端平化后3’端加“A”，接着加入第二接头，得DNA模板，操作简便，无需纯化步骤，降低了DNA片段的损失和浪费，减少了获取成本；高通量测序：通过桥式PCR扩增所制备的DNA模板，成簇后应用IlluminaHiSeq4000测序平台进行双端测序，高通量测序不依赖于参考基因组信息，降低了基因组的复杂性并且成本较低。作为优选，DNA模板的制备过程中酶切反应体系为50μL，其中含有2μL10×NEBbuffer，0.5μL内切酶，0.5μL基因组DNA，其余为双蒸水。该条件下，内切酶稳定性好，不易失活，且所获得的DNA片段纯度高，为后续步骤提供了充足的DNA片段。作为优选，高通量测序过程中桥式PCR扩增所用的上游引物序列为：5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’，下游引物序列为：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。该引物能够与目的基因完全互补，使引物的延伸可以顺利进行，在确保复制准确性的同时大大提高了扩增的效率。作为优选，高通量测序过程中桥式PCR扩增条件为：98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，进行18个循环，最后72℃延伸5min。该条件下，靶序列变性彻底，不影响聚合酶的活性，且降低了PCR反应后期底物的消耗和PCR抑制物的增加多PCR反应效率的影响。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术所公开的一种获取日本鳗鲡高密度SNP分子标记的方法克服了标记数目的匮乏对日本鳗鲡群体遗传结构精确分析的限制，且获取效率高，无需纯化步骤，降低了DNA片段的损失和浪费，减少了获取成本；所采用的酶切体系中内切酶稳定性好，不易失活，且所获得的DNA片段纯度高，为后续步骤提供了充足的DNA片段。具体实施方式以下结合实施例作进一步详细描述：实施例1：一种获取日本鳗鲡高密度SNP分子标记的方法，包括以下步骤：1)提取基因组DNA：采用酚/氯仿抽提法从日本鳗鲡肌肉或鳍条组织中提取基因组DNA，具体过程如下：将样品放入1.5ml离心管剪碎，加入600μLSTE（10mmol/LTriS-Cl，pH8.0；0.1mol/LEDTA，pH8.0；1%m/vSDS），于振荡器上震荡均匀，加入RNase（4μg/μL）6uL，终浓度0.04μg/μL，37℃烘箱内孵育1h，期间不时轻轻翻动离心管，使组织与抽提缓冲液混合均匀，接着加蛋白酶K（20μg/μL）15μL，终浓度0.5μg/μL，颠倒混匀，于50℃烘箱内孵育2h，期间也不时轻轻翻动离心管，使组织与抽提缓冲液混合均匀，接着从烘箱内取出后凉至室温，再加600μL（pH8.0）平衡酚，温和颠倒混匀至乳浊（≥30min），离心（10000r/min，10min），小心吸取上清至另一干净的1.5mL离心管，接着加等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀20min，离心（10000r/min，10min），小心吸取上清至另一干净的1.5ml离心管，接着加等体积氯仿：异戊醇（24：1），颠倒混匀20min，离心（10000r/min，10min），小心吸取上清至另一干净的1.5mL离心管，再加入等体积的预冷酒精，颠倒混匀，-20℃存放2小时以上，离心（12000r/min，10min）产生白色沉淀，轻柔倒去液体，再加入800μL75%的预冷酒精，缓慢颠倒洗涤DNA沉淀，再离心（12000r/min，10min），弃酒精，重复步骤6（注：不要将DNA沉淀倒掉），接着将DNA样品置于真空干燥器干燥或烘箱干燥（视管中乙醇残留量多少适当调整干燥时间）；加入适量TE（10mMTris-HCL，1mMEDTA，pH8.0）溶解，置4ºC冰箱待用或长期保存于-20ºC待用；2)DNA模板的制备：将提取的基因组DNA保存在超纯水中，稀释浓度在25ng/µL以上，DNA的总质量大于1µg，采用限制性内切酶EcoRI对基因组DNA进行酶切，酶切反应体系为50μL(2μL10×NEBbuffer，0.5μL内切酶，0.5μL基因组DNA，其余为双蒸水)，酶切反应条件为：36℃反应9min，然后71℃反应18min，接着向酶切片段中加入第一接头（可与EcoRI酶切DNA缺口互补），将所得片段混池，随机打断到一定的片段（平均片段长度约500bp），通过琼脂糖凝胶电泳回收200bp-400bp的DNA片段，末端平化后加3’dAoverhang，接着加入第二接头，第二接头含有3’dToverhang，可以与随机打断的3’dAoverhang互补结合，从而形成PCR富集扩增前的模板，其中，第一接头包含4个部分：EcoRI限制性内切酶酶切末端，用以对样品进行追踪的6bpbarcode序列（每个barcode序列之间至少存在2个碱基的差异以避免由于测序误差造成的样品归属偏差），与Illumina测序引物结合的互补序列以及与PCR扩增前引物结合的序列；第二接头为局部双链分叉Y型DNA，可实现选择性的扩增同时含有第一接头和第二接头的DNA；3)高通量测序：通过桥式PCR扩增所制备的DNA模板，成簇后应用IlluminaHiSeq4000测序平台进行双端测序，其中，桥式PCR扩增所用的上游引物序列为：5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’，下游引物序列为：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’，桥式PCR扩增体系为：1μL模板，10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获取日本鳗鲡高密度SNP分子标记的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1)提取基因组DNA：采用酚/氯仿抽提法从日本鳗鲡肌肉或鳍条组织中提取基因组DNA；2)DNA模板的制备：采用内切酶对基因组DNA进行酶切，向酶切片段中加入第一接头，将所得DNA片段混池，打断，通过琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段，对所得DNA片段进行末端平化，3’端加“A”，接着加入第二接头，得DNA模板；3)高通量测序：通过桥式PCR扩增所制备的DNA模板，成簇后进行双端测序。

【技术特征摘要】
1.一种获取日本鳗鲡高密度SNP分子标记的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1)提取基因组DNA：采用酚/氯仿抽提法从日本鳗鲡肌肉或鳍条组织中提取基因组DNA；2)DNA模板的制备：采用内切酶对基因组DNA进行酶切，向酶切片段中加入第一接头，将所得DNA片段混池，打断，通过琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段，对所得DNA片段进行末端平化，3’端加“A”，接着加入第二接头，得DNA模板；3)高通量测序：通过桥式PCR扩增所制备的DNA模板，成簇后进行双端测序。2.根据权利要求1所述的一种获取日本鳗鲡高密度SNP分子标记的方法，其特征在于：所述步骤2)中内切酶为限制性内切酶EcoRI。3.根据权利要求1所述的一种获取日本鳗鲡高密度SNP分子标记的方法，其特征在于：所述步骤2)中酶切反应体系为50μL，其中含有2μL10×NEBbuffer，0.5μL内切酶，0.5μL基因组D...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘炳舰，龚理，吕振明，刘立芹，柳意樊，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33