用于高通量微生物学应用的高分辨率系统、试剂盒、设备和方法技术方案

描述了用于培养来自样品的细胞的界定高密度微孔阵列的微加工装置。可以在微孔中加入一系列独特标签以鉴定一个或多个种类的细胞并定位其中培养每个种类的特定微孔。独特标签可以是核酸分子，其包含用于与靶标核酸片段退火的靶标特异性核苷酸序列和预先确定用于鉴定一个或多个微孔的位置特异性核苷酸序列。可以孵育装置以生长多个细胞，其可以分为分析部分和保留部分。描述了用于培养、筛选和测定来自样品的细胞的相对和/或绝对丰度的高通量方法。

High resolution systems, kits, equipment and methods for high throughput microbiological applications

A micromachining device for culturing cells from a sample to define a high-density microporous array is described. A series of unique labels can be added to the micropores to identify one or more species of cells and to locate specific micropores in each species. The unique label can be a nucleic acid molecule, which contains target specific nucleotide sequences used for annealing target nucleic acid fragments, and a site specific nucleotide sequence for identifying one or more micropores. The incubating device can grow a number of cells, which can be divided into an analytical and a reserved part. A high throughput method for the cultivation, screening and determination of the relative and / or absolute abundance of cells from the sample is described.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于高通量微生物学应用的高分辨率系统、试剂盒、设备和方法相关申请的交叉引用本申请要求于2016年2月24日提交的名称为“使用高密度微加工阵列的生物库细胞”的美国临时专利申请第62/299,088号、于2016年2月5日提交的名称为“用于分离、培养、筛选和鉴定细胞的系统、设备和方法”的美国临时专利申请第62/292,091号和于2015年4月21日提交的名称为“用于分离、培养、筛选和鉴定细胞的系统、设备和方法”的美国临时专利申请第62/150,677号的优先权权益，所述临时专利申请的每一个通过引用整体并入本文。
本公开总体上涉及微生物学、微加工、化学、光学、机器人和信息技术的创新。更具体地，本公开涉及用于高通量培养、筛选、分离、取样和/或鉴定生物实体和/或营养物的系统、设备、试剂盒和方法。
技术介绍
用于培养来自环境和其他样品的生物实体的传统技术和工具通常缓慢、费力且昂贵。即使使用这些技术和工具，细胞和其他生物实体仍然常常不能培养成功，造成信息和/或产品机会的缺失。同样，筛选用于特定代谢物、酶、蛋白质、核酸、表型、突变、代谢途径、基因、适应性、能力和/或疗效的生物实体群具有挑战性，需要复杂且昂贵的方法。例如，微生物生活在极其高风险的环境中。为了存活，微生物已经发展出一套令人惊奇的生化工具，包括新的酶、独特的代谢产物、创新的遗传途径，以及操控其环境和微生物邻居的策略，这些强有力的解决方案可以带来新的见解和产品(从拯救生命的抗生素到改善食品生产和安全的肥料)。专利技术简述根据一些实施方案，本公开提供用于精简培养流程、支持高通量筛选和/或开发新的见解和产品的根据一些实施方案的微生物学系统、设备、试剂盒和方法。例如，设备可以包括用于接收含有一个或多个细胞的样品的微加工装置。微加工装置是用于培养一个或多个细胞的高密度微孔阵列。在一些实施方案中，可以提供用于培养细胞的具有高密度微孔阵列的装置。在进一步的实施方案中，可以提供一组用于放入各微孔或一些微孔的独特标签。或者，所述装置可以提供有已经接种入各微孔或一些微孔的独特标签。装置和/或独特标签可以单独提供，或作为试剂盒的一部分提供。例如，试剂盒可以包括用于接收含有一个或多个细胞的样品的微加工装置，所述微加工装置是用于培养一个或多个细胞的高密度微孔阵列。试剂盒还可以包括一组用于放入微孔的独特标签，以鉴别其中培养细胞种类的特定微孔。可以在高密度微孔阵列的各微孔中一个或多个独特标签。试剂盒可以进一步包括用于接种具有独特标签的微孔和/或使用独特标签来追踪培养细胞回到培养它们的特定微孔的说明书。在一些实施方案中，独特标签可以包括具有靶标特异性核苷酸序列和用于鉴别微孔本身的位置特异性核苷酸序列的核酸分子，所述靶标特异性核苷酸序列用于与可能存在于微孔中的细胞或细胞的特定种类(例如生物体)的靶核酸片段退火。可以在特定微孔中放入超过一个的独特标签，使得在该特定微孔中存在超过一个的位置特异性核苷酸序列。即，可以在超过一个的微孔中发现位置特异性核苷酸序列(例如，预先确定以鉴别高密度微孔阵列中微孔的维度)，且独特标签可以是多维的。例如，一组独特标签可以是二维的，包括具有第一位置特异性核苷酸序列的标签和具有第二位置特异性核苷酸序列的标签，预先确定所述第一位置特异性核苷酸序列以识别高密度微孔阵列中第一维度的微孔(例如，行)，预先确定所述第二位置特异性核苷酸序列以识别高密度微孔阵列中第二维度的微孔(例如，列)。第一位置特异性核苷酸序列和第二位置特异性核苷酸序列一起鉴别高密度微孔阵列的特定微孔。因此，特定微孔中独特标签的组合操作以鉴别该微孔。在一些实施方案中，可以提供用于在装置(包括用于培养细胞的高密度微孔阵列)的每个或一些微孔中生长和/或筛选细胞的一种或多种营养物。可以提供一种或多种营养物用于放入全部或一些微孔，例如直接放入微孔、通过膜和/或在渗透性或半渗透性膜上。或者，所述装置可以提供有已经放入各微孔或一些微孔中的一种或多种营养物。营养物可以单独提供、作为培养基的一部分提供，和/或作为试剂盒的一部分提供。试剂盒可以包括用于为在装置的特定微孔内培养的细胞提供一种或多种营养物的说明书。例如，试剂盒可以进一步包括用于培养至少一个种类的至少一个细胞的至少一种营养物。用于培养至少一个种类的至少一个细胞的至少一种营养物可以包括或是：来自至少一个种类的至少一个细胞的天然环境的提取物的成分，源自至少一个种类的至少一个细胞的天然环境的培养基，配制的与至少一个种类的至少一个细胞的天然环境类似的培养基，仅培养所述至少一个种类的至少一个细胞的选择培养基，和/或区分所述至少一个种类的至少一个细胞的鉴别培养基。至少一个种类的至少一个细胞的天然环境可以是生物组织、生物产品、微生物悬浮液、空气、土壤、沉积物、活的有机物、饲料、石油、污水和/或水。在一些实施方案中，可以提供用于将细胞保持在装置(包括用于培养细胞的高密度微孔阵列)的每个或一些微孔内的膜(例如，防止交叉污染)。可以用膜来密封一些或全部微孔。或者，所述装置可以提供有已经密封一些或全部微孔的膜。膜例如可以是不可渗透的、仅气体可渗透的，或允许一种或多种营养物扩散至一个或多个微孔。装置和/或膜可以单独提供，或作为试剂盒的一部分提供。例如，试剂盒可以包括用于接收含有至少一个细胞的样品的微加工装置。试剂盒还可以包括在样品加入微加工装置后，将至少一个细胞保留在高密度微孔阵列的至少一个微孔中的膜。试剂盒可以进一步包括在微孔中加入样品和/或使用膜将培养细胞保持在培养它们的特定微孔中的说明书。在一些实施方案中，提供使用具有用于培养细胞的高密度微孔阵列的装置来培养细胞的步骤。例如，方法可以包括获得界定用于培养来自样品的至少一个细胞的高密度微孔阵列的微加工装置，其可以包括将至少一个独特标签放入高密度微孔阵列的至少一个微孔，在装置中加入包括一个或多个细胞的样品，和/或向全部或部分装置应用膜以将细胞保留在其各自的微孔中。在一些实施方案中，样品在加样前制备。例如，可以稀释样品，使得在高密度微孔阵列的每个微孔中放入不超过一个细胞。方法还可以包括孵育装置以在高密度微孔阵列的至少一个微孔中从至少一个细胞生长多个细胞。在一些实施方案中，公开了用于复制和/或分割在高密度微孔阵列中培养的细胞的步骤，使得可以修饰和/或破坏一部分细胞用于分析(例如，扩增和测序)，而可以保留剩余细胞用于将来的取样和/或基于从分析获得的信息的用途。例如，方法可以包括将高密度微孔阵列的至少一个微孔中的多个细胞分割成第一部分的多个细胞和第二部分的多个细胞。至少一个独特标签可以保持与至少第一部分的多个细胞一起。分割高密度微孔阵列的至少一个微孔中的多个细胞包括从高密度微孔阵列的至少一个微孔移除膜，使得一些细胞保留在高密度微孔阵列的至少一个微孔中，且一些细胞保留在膜上。或者，可以将膜临时剥离以允许取样或穿过(即，穿孔)进行取样。在一些实施方案中，公开了用于分析在高密度微孔阵列中培养的全部或一些细胞的步骤。例如，方法可以包括分析第一部分的多个细胞以确定至少一个目标种类。待分析的细胞可以处于培养它们的同一微孔中，附着于覆盖培养它们的微孔的膜，和/或转移至另一个位置(例如，具有相应的高密度微孔阵列的培养皿或第二装置)。分析可以包括测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种方法，包括：获得用于培养来自样品的至少一个细胞的界定高密度微孔阵列的微加工装置，所述高密度微孔阵列的至少一个微孔包含所述至少一个细胞和至少一个独特标签，所述至少一个独特标签用于鉴定其中培养至少一个种类的至少一个细胞的高密度微孔阵列的至少一个微孔，所述至少一个独特标签包含核酸分子，所述核酸分子包含：靶标特异性核苷酸序列，用于与至少一个目标种类的至少一个细胞中存在的靶标核酸片段退火；和位置特异性核苷酸序列，用于鉴定所述高密度微孔阵列的所述至少一个微孔；孵育所述微加工装置以从所述高密度微孔阵列的至少一个微孔中的至少一个细胞生长多个细胞；将所述高密度微孔阵列的至少一个微孔中的多个细胞分割成第一部分的多个细胞和第二部分的多个细胞，所述至少一个独特标签保持与所述至少第一部分的多个细胞在一起；分析所述第一部分的多个细胞，以：测定所述至少一个目标种类；和基于所述至少一个独特标签鉴定其中培养所述至少一个目标种类的高密度微孔阵列的至少一个微孔；和基于鉴定的其中培养所述至少一个目标种类的高密度微孔阵列的至少一个微孔，在所述第二部分的多个细胞内定位所述至少一个目标种类。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.21 US 62/150,677;2016.02.05 US 62/292,091;1.一种方法，包括：获得用于培养来自样品的至少一个细胞的界定高密度微孔阵列的微加工装置，所述高密度微孔阵列的至少一个微孔包含所述至少一个细胞和至少一个独特标签，所述至少一个独特标签用于鉴定其中培养至少一个种类的至少一个细胞的高密度微孔阵列的至少一个微孔，所述至少一个独特标签包含核酸分子，所述核酸分子包含：靶标特异性核苷酸序列，用于与至少一个目标种类的至少一个细胞中存在的靶标核酸片段退火；和位置特异性核苷酸序列，用于鉴定所述高密度微孔阵列的所述至少一个微孔；孵育所述微加工装置以从所述高密度微孔阵列的至少一个微孔中的至少一个细胞生长多个细胞；将所述高密度微孔阵列的至少一个微孔中的多个细胞分割成第一部分的多个细胞和第二部分的多个细胞，所述至少一个独特标签保持与所述至少第一部分的多个细胞在一起；分析所述第一部分的多个细胞，以：测定所述至少一个目标种类；和基于所述至少一个独特标签鉴定其中培养所述至少一个目标种类的高密度微孔阵列的至少一个微孔；和基于鉴定的其中培养所述至少一个目标种类的高密度微孔阵列的至少一个微孔，在所述第二部分的多个细胞内定位所述至少一个目标种类。2.权利要求1所述的方法，进一步包括从所述第二部分的多个细胞选取所述至少一个目标种类的至少一个细胞。3.权利要求1所述的方法，其中：所述至少一个独特标签包含第一独特标签和第二独特标签；所述第一独特标签包含预先确定的第一位置特异性核苷酸序列，以鉴定所述高密度微孔阵列中的微孔的第一维度；所述第二独特标签包含预先确定的第二位置特异性核苷酸序列，以鉴定所述高密度微孔阵列中的微孔的第二维度；和所述第一位置特异性核苷酸序列和所述第二位置特异性核苷酸序列一起鉴定所述高密度微孔阵列的至少一个微孔。4.权利要求3所述的方法，其中：所述第一独特标签包含含有正向聚合酶链式反应(PCR)引物的第一靶标特异性核苷酸序列；和所述第二独特标签包含含有反向PCR引物的第二靶标特异性核苷酸序列。5.权利要求1所述的方法，其中获得所述微加工装置包括将所述至少一个独特标签加入所述高密度微孔阵列的至少一个微孔。6.权利要求1所述的方法，其中获得所述微加工装置包括将包含至少一个细胞的样品上样到所述微加工装置。7.权利要求1所述的方法，其中获得所述微加工装置包括施用膜以将所述至少一个细胞保留在所述高密度微孔阵列的至少一个微孔中。8.权利要求7所述的方法，其中所述膜是仅气体可渗透和不可渗透中的至少一种。9.权利要求7所述的方法，其中所述膜允许营养介质扩散入所述高密度微孔阵列的至少一个微孔。10.权利要求7所述的方法，其中分割所述高密度微孔阵列的至少一个微孔中的多个细胞包括从所述高密度微孔阵列的至少一个微孔移除所述膜，使得所述第一部分的多个细胞仍然在所述高密度微孔阵列的至少一个微孔中，且所述第二部分的多个细胞仍然与所述膜的表面连接。11.权利要求10所述的方法，其中在所述第二部分的多个细胞内定位所述至少一个目标种类包括鉴定与其中培养所述至少一个目标种类的高密度微孔阵列的至少一个微孔相对应的所述膜的表面上的区域。12.权利要求7所述的方法，其中分割所述高密度微孔阵列的至少一个微孔中的多个细胞包括从所述高密度微孔阵列的至少一个微孔移除所述膜，使得所述第一部分的多个细胞仍然与所述膜的表面连接，且所述第二部分的多个细胞仍然在所述高密度微孔阵列的至少一个微孔中。13.权利要求1所述的方法，其中分析所述第一部分的多个细胞以测定所述至少一个目标种类存在或不存在包括对所述第一部分的多个细胞进行聚合酶链式反应(PCR)以基于所述至少一个独特标签的靶标特异性核苷酸序列来扩增在所述第一部分的多个细胞中存在的任何靶标核酸片段。14.权利要求13所述的方法，其中分析所述第一部分的多个细胞以测定所述至少一个目标种类存在或不存在进一步包括将任何PCR扩增的靶标核酸片段进行测序。15.权利要求14所述的方法，其中所述测序包括进行下一代测序(NGS)。16.权利要求1所述的方法，进一步包括补充用于培养至少一个种类的至少一个细胞的至少一种营养物。17.权利要求16所述的方法，其中所述用于培养至少一个种类的至少一个细胞的至少一种营养物包含以下的至少一种：来自所述至少一个种类的至少一个细胞的天然环境的提取物；源自所述至少一个种类的至少一个细胞的天然环境的培养基；配制的与所述至少一个种类的至少一个细胞的天然环境类似的培养基；仅培养所述至少一个种类的至少一个细胞的选择培养基；和区分所述至少一个种类的至少一个细胞的鉴别培养基。18.权利要求17所述的方法，其中所述至少一个种类的至少一个细胞的天然环境可以是以下的至少一种：生物组织、生物产品、微生物悬浮液、空气、土壤、沉积物、活的有机物、饲料、石油、污水和水。19.权利要求1所述的方法，其中所述至少一个细胞包括以下的至少一种：古细菌细胞、细菌细胞和真核细胞。20.权利要求1所述的方法，其中所述至少一个目标种类基于核酸和基因中的至少一种选择。21.一种方法，包括：获得用于培养来自样品的至少一个细胞的界定高密度微孔阵列的微加工装置，所述高密度微孔阵列的至少一个微孔包含所述至少一个细胞；孵育所述微加工装置以从所述高密度微孔阵列的至少一个微孔中的至少一个细胞生长多个细胞；筛选所述多个细胞以测定至少一个目标种类的多个细胞的存在或不存在；和如果所述至少一个目标种类存在，从其中培养所述至少一个目标种类的高密度微孔阵列的至少一个微孔选取所述至少一个目标种类的至少一个细胞。22.权利要求21所述的方法，其中将所述多个细胞筛选到至少一个目标种类包括基于以下的至少一种进行分析：代谢物、代谢途径、酶、蛋白质、核酸、表型、基因、突变、适应性和能力。23.权利要求21所述的方法，其中：所述高密度微孔阵列的至少一个微孔进一步包含至少一个独特标签，以鉴定其中培养至少一个种类的至少一个细胞的高密度微孔阵列的至少一个微孔，所述至少一个独特标签包含核酸分子，所述核酸分子包含：靶标特异性核苷酸序列，用于与所述至少一个目标种类中存在的靶标核酸片段退火；和位置特异性核苷酸序列，用于鉴定所述高密度微孔阵列的所述至少一个微孔；该方法进一步包括，如果存在至少一个目标种类，使用所述位置特异性核苷酸序列来鉴定其中培养所述至少一个目标种类的高密度微孔阵列的至少一个微孔。24.权利要求23所述的方法，其中所述至少一个目标种类包含其中存在所述靶标核酸片段的至少一个细胞，其中所述靶标核酸片段包括涉及以下至少一种的遗传密码：代谢物、代谢途径、酶、蛋白质、核酸、表型、基因、突变、适应性和能力。25.权利要求21所述的方法，其中：所述方法进一步包括，在筛选所述多个细胞以测定至少一个目标种类的多个细胞的存在...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·C·布莱内，M·W·西利，R·斯托克，K·曾格勒，S·康拉德逊，P·克里斯蒂，A·哈洛克，
申请(专利权)人：通用自动化实验技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US