The invention discloses a method for isolation and identification of pig streptococcus, which belongs to the technical field of small species identification. Total nucleic acid extracted from the microorganism and construct high-throughput sequencing library; find the mutation sites on the genome; through the slide screening of high polymorphic loci, and candidate loci multiplex amplification primers on both sides of the design; using solid culture medium separation in a sample of single colony and further purified to obtain monoclonal colony; genomic DNA extraction after the colonies were amplified and sequenced using primers designed above; sequencing results were classified based on the monoclonal colony, with different genotypes of different small colonies as a follow-up study. This method does not need to know the number of small samples and the abundance of information, no physiological and biochemical identification test to screening in the traditional process, only by high-throughput sequencing and amplification can be isolated from the samples of all kinds of small, simple process, fast and process specifications.
【技术实现步骤摘要】
一种猪链球菌小种分离鉴定方法
本专利技术属于小种鉴定
,具体涉及一种猪链球菌小种分离鉴定方法。
技术介绍
猪链球菌病是由不同群的链球菌引起的一种急性高热性传染病。流行特点是仔猪以败血型和脑膜炎型为主,中、大猪以关节炎型为主,一年四季均可发病,传播迅速,死亡率高。猪链球菌病的病情复杂,流行情况无特征,有的根据临床症状和病理变化可做出初步诊断,有的还需实验室检查,且不同小种的病原菌的致病性不同;该病在诊断时要和急性猪丹毒、猪瘟、猪李氏杆菌病等相区分。小种又称生理小种、株系等,是指形态上没有明显差异,但在生理生化特性、培养性状、致病性等方面存在差异的同种微生物的不同群体。由于这些小种在致病性等特性上具有明显的差异,因此在做菌种分离和鉴定时往往需要做到小种的水平才具有意义。在现有技术中,至少存在以下问题:由于各小种之间在形态上没有明显差异,在获取样品并做分离培养后依然无法知道样品中包含有几个小种,具体是什么小种,只能通过一系列分离培养和生理生化测试来鉴别。这导致三个问题,一是某些小种会被漏筛;二是挑取需反复对多个单克隆菌落做生理生化分析来筛选小种;三是无法在链球菌感染后快速针对性的对猪场消毒,杀灭存在的各个链球菌小种。
技术实现思路
本发的明目的是提供一种猪链球菌小种分离鉴定方法。本专利技术所采用的技术方案是:一种猪链球菌小种分离鉴定方法,包括以下步骤:(1)提取需要分离和鉴定的病猪的总核酸,然后构建高通量测序文库;(2)采用高通量测序的方法对文库进行高覆盖深度的测序,并将测序结果比对到相应物种的参考基因组上;(3)根据比对结果获取所有的变异位点,然后按照窗口平 ...
【技术保护点】
一种猪链球菌分离鉴定方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)提取需要分离和鉴定的病猪的总核酸,然后构建高通量测序文库;(2)采用高通量测序的方法对文库进行高覆盖深度的测序,并将测序结果比对到相应物种的参考基因组上;(3)根据比对结果获取所有的变异位点,然后按照窗口平移获得每个窗口的基因型数目,计算每个窗口的多态性,选择多态性高且处于单拷贝区域作为候选分子标记位点;(4)在每个分子标记位点的两侧寻找保守区域,在保守区域设计扩增引物;(5)将需要分离和鉴定的病猪组织样本研磨后做10倍稀释后涂平板,恒温培养后挑取单个的菌落并在新的固体培养基平板上纯合后获得单克隆的菌落;(6)提取菌落的核酸后用步骤(4)设计的引物进行扩增,对扩增产物测序后分型;(7)所有分型结果相同的单克隆仅保留一个;若有部分已发现基因型在所有克隆中都不存在,则重新挑取菌落纯化并重复上述过程,直到获得该猪链球菌。
【技术特征摘要】
1.一种猪链球菌分离鉴定方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)提取需要分离和鉴定的病猪的总核酸,然后构建高通量测序文库;(2)采用高通量测序的方法对文库进行高覆盖深度的测序,并将测序结果比对到相应物种的参考基因组上;(3)根据比对结果获取所有的变异位点,然后按照窗口平移获得每个窗口的基因型数目,计算每个窗口的多态性,选择多态性高且处于单拷贝区域作为候选分子标记位点;(4)在每个分子标记位点的两侧寻找保守区域,在保守区域设计扩增引物;(5)将需要分离和鉴定的病猪组织样本研磨后做10倍稀释后涂平板,恒温培养后挑取单个的菌落并在新的固体培养基平板上纯合后获得单克隆的菌落;(6)提取菌落的核酸后用步骤(4)设计的引物进行扩增,对扩增产物测序后分型;(7)所有分型结果相同的单克隆仅保留一个;若有部分已发现基因型在所有克隆中都不存在,则重新挑取菌落纯化并重复上述过程,直到获得该猪链球菌。2.根据权利要求1所述的猪链球菌分离鉴定方法,其特征在于,所述步骤(1)中提取需要分离和鉴定的病猪的总核酸时需要充分裂解细胞,确保提出每个小种的基因组序列。3.根据权利要求1所述的猪链球菌分离鉴定方法,其特征在于,所述步骤(2)中测序时产生的测序片段数量要达到200倍数据,确保所有小种均可以被有效检测到。4.根据权利要求1所述的猪链球菌分离鉴定方法,其特征在于,所述步骤(3)中分子标记位点的筛选以窗口平移的方式进行,窗口长度设为L;在窗口平移的过程中仅仅考虑可以完整覆盖该窗口的测序片段,其他测序片段均不考虑。5.根据权利要求1所述的猪链球菌分离鉴定方法,其特征在于,所述步骤(3)中变异位点的分析以测序片段为单位展开,标记出每条测序片段上与参考基因组不同的每个碱基位点及其突变类型;把具有相同突变碱基位点和突变类型的reads定义为该窗口内的一个基因型。6.根据权利要求4或5所述的猪链球菌分离鉴定方法,其特征在于,所述获得该窗口的所有候选基因型,统计每类基因型的测序片段数量,并除以完整覆盖该窗口的测序片段的总数量,从而获得该基因型的频率。7.根据权利要求1所述的猪链球菌分离鉴定方法,其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员:方治伟,方光明,周俊飞,李伦,彭海,高丽芬,李丽丽,胡长峰,刘致浩,
申请(专利权)人:江汉大学,
类型:发明
国别省市:湖北,42
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