一种快速获取大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体序列的测序方法及引物序列技术

本发明专利技术公开一种快速获取大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体序列的测序方法及引物序列，包括：步骤1、为目的基因的cDNA添加接头序列；步骤2、用接头序列和大鼠抗体可变区特异性引物通过PCR扩增大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区；步骤3、用PCR产物直接测定单克隆抗体序列。所述接头序列为5’‑RACE接头序列，该5’‑RACE接头序列为5’‑AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACACrGrGrGp‑3’。本发明专利技术的测序方法，成本低，操作简便；操作步骤少，可避免多步骤操作引起的样品损失。本发明专利技术的测序方法的时间大大减少到24小时以内。

Sequencing method and primer sequence for rapid acquisition of monoclonal antibody sequence of rat hybridoma cells

【技术实现步骤摘要】
一种快速获取大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体序列的测序方法及引物序列
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种采用接头序列用PCR产物直接测序的方法来特异性扩增大鼠杂交瘤细胞内抗体基因完整编码序列的方法。
技术介绍
RACE技术(rapidamplificationofcDNAends，RACE)是根据基因已知的部分序列扩增未知片段的方法。若要克隆编码区的序列，需要先获得5’端一侧的未知序列，进而获得完整的编码序列。RACE技术是通过结合逆转录和PCR扩增基因未知片段的技术，已经成为扩增5’端未知基因完整编码序列的最常用技术。基本原理：首先获得包含目的基因mRNA的RNA样品，并利用基因特异的引物进行逆转录，获得目的基因相应的cDNA；在cDNA的3’末端(对应mRNA序列5’末端)加上特定的序列，通常将这段添加在cDNA上的特定序列称为接头(adaptor)，同时合成与adaptor序列相匹配的引物，称为锚定引物；然后利用基因已知序列设计基因特异性引物，与锚定引物配对进行PCR扩增，得到未知部分的片段；再将扩增得到的片段测序，即可获得目的基因未知部分的序列。目前按接头序列的添加方法可分为3大类：末端转移酶法(terminaldeoxynucleotidyltransferasemethod，TdTmethod)、接头连接法(adaptorligation)和寡核苷酸帽法(oligocapingmethod)。近年出现了一些可同时扩增编码区3’一侧与5’一侧未知片段的技术，并推出了相应的试剂盒，如GeneRacer(Invitrogen公司)、SMARTRACE(Takara-BD公司)等。这些技术的基本原理是用oligo(dT)起始逆转录，在完整mRNA逆转录所得的完整cDNA产物的3’端及5’端分别添加3’-adaptor及5’-adaptor，使所有完整的cDNA在两端都带有adaptor，成为包含所有基因信息的通用模板。再利用目的基因的特异引物与某一端的锚定引物搭配，则可利用同一份通用模板获得不同基因、不同末端的未知序列。这两种方法都需要先将逆转录产物进行纯化，才能添加adaptor，而cDNA在纯化过程中会发生损失，因此需要制备较大量的cDNA。虽然寡核苷酸帽法可以选择性地对5’端完整的mRNA进行扩增，解决了末端转移酶法和接头连接法对mRNA完整性无选择性的问题。但寡核苷酸帽法存在需要对RNA进行多步操作，在各步的酶反应之间又都需要对RNA进行纯化，而且RNA很容易被降解，因此很容易损失掉大量的RNA，从而降低了此后RACE工作的效率，对于丰度较低的mRNA，甚至很难得到扩增产物。用通用模板作为起始材料，虽然可高通量地进行基因克隆，但是若仅需要通过5’-RACE扩增少数5’端未知基因编码区的未知片段，通用模板并不适合。原因有如下2点：首先，通用模板的复杂性很高。通用模板对基因没有选择性，所有基因的完整cDNA均添加有adaptor，理论上包含所有基因对应的cDNA。在复杂的模板中，目的基因cDNA含量相对较低，对于表达丰度较低的基因，克隆难度则更大。而且，模板越复杂，PCR反应中越容易发生非特异扩增，影响目的片段在PCR反应中的扩增效率，非特异的扩增产物还会干扰目的条带的选择。其次，通用模板制备过程中，信息损失的可能性较大。这是因为，通用模板对RNA以及逆转录反应的完整性要求都很高，不完整mRNA的逆转录产物以及逆转录反应中链延伸不完全的cDNA都不会被添加adaptor；而逆转录反应的链延伸过程又很容易发生未成熟终止，若待延伸的mRNA模板较长，或具有较复杂的二级结构，则未成熟终止的可能性较大。制备通用模板时逆转录反应需要从mRNA的3’末端一直延伸到5’末端，对于编码区较长的基因，很难得到基因的完整cDNA。这些都会增加5’-RACE的工作量，并可能影响5’-RACE结果。此外，现有的所有5’-RACE方法中引物的设计和使用都受到强烈的限制。末端转移酶法只能添加一串相同的核苷酸，通用模板只能使用同一套adaptor，接头连接法和寡核苷酸帽法中的adaptor虽然可以自行设计，但由于链的长度影响连接反应的效率，因此也只能添加长度有限的adaptor(一般为15～30bp)。这样就无法使用最适合于目的物种、目的基因的adaptor和相应的锚定引物，甚至模板中的部分基因序列中很可能含有锚定引物的非特异性结合位点。在PCR扩增时需要将锚定引物与基因特异引物搭配，研究人员就必须根据锚定引物的特点设计基因特异引物，这样就会缩小基因特异引物的选择范围，最适合于目的基因的引物往往无法直接用于扩增。引物设计的灵活性有限，就使得研究人员需要花费较大工作量探讨PCR条件，影响基因克隆效率。尽管目前的测序方法已经比较稳定了，但是存在测定次数多，干扰大，成本高的问题。比如一个单克隆需要进行克隆到T载体中进行多次测定比较；还有就是杂交瘤细胞中很有很多内源性尤其是小鼠的干扰抗体序列，在测定中会干扰甚至覆盖目的抗体序列信息；有时需要反复测定，获得大鼠杂交瘤细胞中的抗体可变区序列有时需要5-10个工作日，费时费力。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种快速获取大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体序列的测序方法，其可以排除内源性小鼠抗体序列的干扰，可利用PCR产物直接测序，大大降低了杂交瘤内大鼠抗体序列测定的成本和操作时间。为解决上述技术问题，本专利技术提供的一种快速获取大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体序列的测序方法，包括以下步骤：步骤1、为目的基因的cDNA添加接头序列；步骤2、用接头序列和大鼠抗体可变区特异性引物通过PCR扩增大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区，步骤3、用PCR产物直接测定单克隆抗体序列。其中，步骤1中，cDNA添加接头的具体方法如下：1.1根据大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体基因设计特异性逆转录引物，设计接头序列，接头序列3’末端有至少3个连续的鸟嘌呤；1.2在逆转录体系中加入接头序列和特异性逆转录引物，以接头序列作为模板转换引物，在逆转录即将完成时，接头序列3’端的oligo(dG)会与cDNA末端的dC配对，具有末端转移酶活性的逆转录酶则发生模板转换，以接头序列为模板继续进行链延伸，从而得到3’端添加了接头序列的单链cDNA片段，实现了5’-RACE接头序列添加。在1.1中，所述接头序列为适用于来源于大鼠杂交瘤的单克隆抗体序列测定的5’-RACE接头序列，该5’-RACE接头序列为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACACrGrGrGp-3’。其中，步骤2中，以3’端添加了接头序列的单链cDNA片段为模板，用目的基因特异性巢式PCR引物和巢式锚定引物进行巢式PCR扩增；对获得的巢式PCR扩增片段进行电泳，切胶回收纯化PCR产物。其中，步骤3中，对纯化后的PCR产物进行测序，再利用软件分析，获得目的基因3’末端至5’末端的序列，验证后即得到5’端未知目的基因的完整编码序列。本专利技术适用于杂交瘤细胞中大鼠的抗体的可变区的编码序列的测定。轻链根据恒定区抗原性的不同,分为kappa链和lambda链,免疫球蛋白由此分为κ型和λ型。步骤2中重链和轻链分别设计恒定区引物，特异性PCR扩增产物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速获取大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体序列的测序方法，其特征在于，包括：步骤1、为目的基因的cDNA添加接头序列；步骤2、用接头序列和大鼠抗体可变区特异性引物通过PCR扩增大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区；步骤3、用PCR产物直接测定单克隆抗体序列。

【技术特征摘要】
1.一种快速获取大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体序列的测序方法，其特征在于，包括：步骤1、为目的基因的cDNA添加接头序列；步骤2、用接头序列和大鼠抗体可变区特异性引物通过PCR扩增大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区；步骤3、用PCR产物直接测定单克隆抗体序列。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中的具体方法为：1.1根据大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体基因设计特异性逆转录引物，设计接头序列，接头序列3’末端有至少3个连续的鸟嘌呤；1.2在逆转录体系中加入接头序列和特异性逆转录引物，以接头序列作为模板转换引物，在逆转录即将完成时，接头序列3’端的oligo(dG)会与cDNA末端的dC配对，具有末端转移酶活性的逆转录酶则发生模板转换，以接头序列为模板继续进行链延伸，从而得到3’端添加了接头序列的单链cDNA片段。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1.1中，所述接头序列为5’-RACE接头序列，该5’-RACE接头序列为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACACrGrGrGp-3’。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中，以3’端添加了接头序列的单链cDNA片段为模板，用目的基因的特异性引物进行巢式PCR扩增；对获得的巢式PCR扩增片段进行电泳，切胶回收纯化PCR产物。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，轻链根据恒定区抗原性的不同,分为kappa链和lambda链，大鼠kappa轻链扩增引物为5’-AGGATGATGTCTTATGAACAA-3’(Rat-CK)；大鼠lambda轻链扩增引物为5’-ACCATTTGCCTTCCAGGCCAC-3’(Rat-CL1)，5’-ACCATCTGCCTTCCAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：于海翔，根纳季·格洛洛波夫，李竞，陈智胜，
申请(专利权)人：上海药明生物技术有限公司，无锡药明康德生物技术股份有限公司，苏州药明康德检测检验有限责任公司，
类型：发明
国别省市：上海,31