一种循环肿瘤DNA肝癌驱动基因高通量检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于循环肿瘤DNA肝癌驱动基因高通量检测方法，本方法选取目前肝癌常见的突变基因，结合第二代高通量测序技术，更全面的检测肝癌的基因突变情况。由于可以采用患者的血浆样本，因此，本方法可以极大的降低患者检测的创伤；其次、对75个肝癌基因进行全外显子检测，比基于real‑time PCR和一代Sanger测序技术平台的检测方法更全面；由于只对75个基因进行检测，能以更高的测序深度对样本进行检测，因此，检测的精度可以达到0.1%。从而为患者的更多、更优的个体化精准治疗方案提供参考。

【技术实现步骤摘要】
一种循环肿瘤DNA肝癌驱动基因高通量检测方法
本专利技术涉及一种基因突变检测方法，尤其涉及循环肿瘤DNA肝癌驱动基因高通量检测方法。
技术介绍
肝细胞癌为第五大最常见的癌症，全球癌症相关死亡率排第三。中国是肝癌大国，2012年全国肿瘤统计显示中国男性肝癌发病率为293,318人，女性肝癌发病率为101,452人，男女共有394770人发病，占到全球新发肝癌患者的52.7%，名副其实的全球第一。预计在2016年，中国男性肝癌发病率为326,698，女性肝癌发病率为111,017，两者相加437,715人，相当于中国一个县的人口，防癌与治疗形式十分严峻。如何筛选有效的肿瘤分级分子标记物并根据分子标记物进行针对性的治疗是目前迫切关注的问题。在亚洲，包括中国、韩国等，由于地方性乙型肝炎病毒感染等原因肝癌发生率很高。目前已知的肝癌发生分子机制中，高频突变主要在维护端粒长度的信号通路上，主要是TERT启动区突变（59%）和HBV插入TERT启动区突变引起（20%）；其次是Wnt/β-catenin信号通路，主要是CTNNB1（10-32%）和AXIN1（15%）突变引起；其它还有细胞周期控制途径、表观遗传修饰通路、AKT/mTOR和Ras/raf/MAP激酶信号通路、氧化胁迫通路、JAK/STAT通路等；相应发生突变的基因有TP53、CDKN2A、ATM、IRF2、MLL、FGF19、PIK3CA和JAK1等。最近，有研究表明，在59%的肝癌患者以及25%的肝硬化癌前病变患者中TERT启动子区域都发生了突变。这些结果预示着TERT可能是一个很好的预后指标。端粒酶逆转录酶（TERT）编码催化端粒酶逆转录活性的一个亚基，目的是保持端粒的长度。TERT活性的增加是肿瘤发生的一个标志，TERT的转录调控是其癌症发生激活的主要原因。TERT启动子区域是其表达调控最重要的区域，这里结合了许多的调控因子，能够直接激活或者抑制TERT的表达。在膀胱癌的研究中，TERT启动子区域的突变使得患者预后不好，生存期缩短，复发几率远大于TERT启动子区域野生型患者。TERT启动子区域的突变与BRAF突变经常共同存在于乳头状甲状腺癌中，这部分患者预后与TERT启动子区域野生型患者也有很大的差异。TERT启动子区域野生型的肝癌患者的预后要好于突变型患者。由于TERT启动子区域突变在肝癌中频发并与肿瘤的发生密切相关。此外，CTNNB1、AXIN1、TP53、CDKN2A、ATM、IRF2、FGF19、PIK3CA和JAK1等基因的突变与肝癌的发生都有显著的相关性。这些基因突变在中国人群中的分布和预后的相关性方面都亟待研究。因此，研究这些基因突变与肝癌预后及复发的关系是一个重要的课题。当前，癌症基因检测主要以组织样本为主。基于肿瘤组织样本的检测，存在两个问题：一、肿瘤组织大都来源于活检技术即穿刺和活检钳活检，这样会给病人带来极大的痛苦，是有创检测；二、对于某些晚期的病人，不能穿刺或者手术，病人样本就很难获取，因此就很难根据检测的结果对病人进行靶向用药。而且，采用靶向治疗的患者，都已经处于中晚期，身体状况较差。因此，尽量减少检测对身体的创伤具有非常重要意义。另一方面，随着精准治疗的不断发展，越来越多靶向治疗可供选择；同时也存在越来越多的靶向位点需要检测。因此，会产生一个问题，更多的治疗选择需要从患者身上获得更多的样品。基于上述发展过程中产生的矛盾，临床上迫切需要一种能够替代目前市场上需要较多样本的基因检测方法。近年来研究发现肿瘤患者外周血存在肿瘤循环DNA(ctDNA)；而且越来越多的临床研究表明是非常好的组织样本的代替品。本专利采用血浆作为检测样本，有如下优势：1、提供肿瘤实时信息---当前肿瘤的突变状态；2、非侵入性液体活检---减少患者的成本和风险；3、没有肿瘤组织可用---仍然可以方便进行检测；4、消除组织样本偏差---评估全身肿瘤的整体状态。因此，个体化精准治疗，能提高晚期肺癌患者的生存质量和生存时间。但是需要对靶标位点进行精准检测。而利用血浆样本，结合第二代高通量测序技术，可以更全面的检测肺癌的基因突变信息，从而获得更好的治疗方案，提高预后效果。
技术实现思路
本专利技术提供一种准确度高、临床意义明确的肝癌驱动基因高通量检测方法。实现本专利技术目的的一种肝癌驱动基因高通量检测方法，包括如下步骤:(1)根据人类基因组HG19，调取肝癌高频突变基因的外显子序列。常见肝癌基因列表如下：调取外显子的序列包含列表基因的基因区域，以及己知各个转录本的启动子区域;(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小60bp;(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应和转录的方法扩增出大量的带有生物素标记的探针，并制作肝癌基因高通量捕获试剂盒;所述试剂盒检测方法包括如下步骤:从患者血浆中提取100-300ngcfDNA(CellFreeDNA)，然后利用肝癌常见基因探针将目的基因序列捕获出来，再用测序仪(IlluminaNextseq500)进行高通量测序，进而分析，找出与肝癌相关基因的所有突变信息，从而得到患者肺癌的变异情况，以达到准确基因诊断的目的。利用测序仪(IlluminaNextseq500)进行高通量测序，分析的过程包括单核昔酸多态性分析(SNP分析)过程、插入缺失标记分析(InDel分析)、基因融合和大片段扩增缺失分析流程;所述单核昔酸多态性分析(SNP分析)过程包括如下步骤:(1)测序仪(IlluminaNextseq500)获取原始短序列并去除测序数据中的接头;(2)用TrimGalore进行QC并去除低质量数据;(3)把短序列用BWA-Burrows-WheelerAlignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数:bwaaln-L-l40-i10-k2-t7-e40-M3-f);(4)用GATK软件找出序列中所含有的单核昔酸多态性(SNP)的信息;(5)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等，过滤低质量值(小于25)和低覆盖度(小于10)的单核昔酸;(6)利用ANNOVAR3、人类基因组数据库(HOMO_SAPIENS_NCBI_BUILD37.2)、dbSNP、COSMIC68信息对单核昔酸进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核昔酸功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测单核昔酸影响蛋白功能预测;(7)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的单核昔酸作为候选的单核昔酸，在候选的单核昔酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的单核昔酸。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的单核昔酸作为最后疾病相关的候选单核昔酸;所述插入缺失标记分析(InDel分析)流程包括如下步骤:(1)把去除接头序列和低质量的测序数据用BWA-Burrows-WheelerAlignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数:bwaaln-L-l40-i10-k2-t7-e40-M3-f);(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于循环肿瘤DNA肝癌驱动基因高通量检测方法，包括肝癌高频突变基因扫描试剂盒的方法和试剂盒的筛查方法。

【技术特征摘要】
1.一种用于循环肿瘤DNA肝癌驱动基因高通量检测方法，包括肝癌高频突变基因扫描试剂盒的方法和试剂盒的筛查方法。2.肝癌高频突变基因扫描试剂盒的方法包括如下步骤：(1)根据人类基因组HG19，调取肺癌高频突变基因的外显子序列和内含子序列；常见肝癌基因列表如下：TP53CTNNB1AXIN1ALBARID2ARID1AACVR2ANFE2L2RPS6KA3KEAP1CDKN2ACDKN1ARB1TSC2HNF1AZNRF3PTENTSC1HGFAPOBATMSETD2SMARCA2JAK3TERTDAPK1CHD7CREBBPCCND1CDKN2BFGF19FGF3FGF4PIK3CAKRASNRASHRASEGFRMETERBB2BRAFKDRPDGFRBKITFLT3AXIN2MYCJAK1JAK2STAT3IGF1RIGF2RAPCAKT1PDGFRAVEGFAIRF2CCNE1MTORFGFR1FGFR2FGFR3FGFR4ARID1BPBRM1TCF7L2EP300ATRTTNFGF5UBE3CFLT1KMT2BKMT2CKMT2DEGFRBRAFDDR2MEKPDGFRAALKRETNTRK1PIK3CATP53ROS1KRASFGFR3PTENMETNRASRICTORFGFR1HER2HRASAKT1BIM调取的序列包含列表基因的基因区域，以及己知各个转录本的启动子区域和内含子区域;(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小60bp;(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应和转录的方法扩增出大量的带有生物素标记的探针，并制作肝癌基因扫描试剂盒;所述试剂盒筛查方法包括如下步骤:从病人血液中提取100-300ngcfDNA(CellFreeDNA)，然后利用肝癌常见基因探针将目的基因序列捕获出来，再用测序仪(IlluminaNextseq500)进行高通量测序，进而分析，找出与肝癌相关基因的所有突变信息，从而得到患者肝癌的变异情况，以达到准确基因诊断的目的。3.根据权利要求1所述的一种肝癌高频突变基因的筛查方法，其特征在于：采用测序仪进行高通量测序，分析的过程包括单核昔酸多态性分析过程、所述括入缺失标记分析流程、大片段扩增确实分析流程和基因融合分析流程;所述单核昔酸多态性分析过程包括如下步骤:(1)测序仪获取原始短序列;(2)去除测序数据中的接头和低质量数据;(3)把短序列定位到人类基因组数据相应的位置上;(4)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等;(5)过滤低质量值和低覆盖度的单核昔酸;(6)利用CCDS、人...

【专利技术属性】
技术研发人员：张道允，巩子英，叶建伟，王伟，
申请(专利权)人：嘉兴允英医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33