一种白血病驱动基因的高通量检测方法技术

本发明专利技术公开了一种白血病基因突变和基因融合的高通量检测方法，本方法选取目前白血病最常见的突变基因和融合基因，结合第二代高通量测序技术，更全面的检测白血病的基因突变和融合情况。第二代高通量测序技术比目前多采用经典的Sanger测序方法检通量大、测序时间段、精确度高、费用低和信息量丰富，可以在短时间内对目标基因进行精确定位和分析。本方法在高通量检测技术的帮助下，可以为临床医生提供更为详尽的基因突变和融合谱来综合判断白血病的预后、指导个性化治疗。

【技术实现步骤摘要】
一种白血病驱动基因的高通量检测方法
本专利技术涉及一种白血病驱动基因的高通量检测方法，尤其涉及一种白血病基因突变情况的检测方法。
技术介绍
白血病(leukemia)也称作“血癌”，是一种造血干细胞的恶性克隆性疾病(clonaldisorder)。几乎所有年龄段的人们都有患上白血病的可能。2012年全世界范围内大约352000人患有不同类型的白血病，其中265000人死于这种恶性肿瘤。在所有白血病患者中，大约90％是成年人。白血病在儿科恶性肿瘤的发病率中居第一位，它的死亡率在导致儿童及35岁以下成年人死亡的恶性肿瘤中排首位。白血病有多种类型，按照病程进展的速度分为急性和慢性，主要包括四种类型：慢性骨髓性白血病(ChronicMyelocyticLeukemia,CML)，慢性淋巴性白血病(ChronicLymphocyticLeukemia,CLL)，急性骨髓性白血病(AcuteMyelocyticLeukemia,AML)和急性淋巴性白血病(AcuteLymphocyticLeukemia,ALL)。白血病病因是由于细胞内DNA变异形成的骨髓中造血组织生成大量不成熟、无法正常工作的白细胞，妨碍骨髓的其他功能，使白细胞、红细胞、血小板减少进而导致其他生理功能失调。白血病能够扩散到淋巴结、脾、肝、中枢神经系统和人体其它器官，使得白血病症状繁多。白血病发生基因突变的基因一般有：CEBPA、DNMT3A、IDH1、KIT、KRAS、NPM1、TET2、FBXW7、FLT3、JAK1、NOTCH、SH2B3(LNK)、MPL等，而近年来，由于细胞生物学和分子生物学技术的发展，已经认识到大部分的白血病中存在着染色体畸变。迄今报道白血病至少涉及50种以上的染色体畸变，累及数目更多的融合基因，这些异常已经成为不同类型白血病的分子生物学特异性标志。对白血病相关融合基因进行常规检测，可以为白血病诊断、分型、临床治疗选择和预后判断提供重要依据。目前白血病常见融合基因有：CBFB/MYH11、AML1/ETO、PML/RARа、E2A/PBX1、MLL/AF4、BCR/ABL、TEL/AML1、SIL/TAL1、MLL/AF10、MLL/AF9、MLL/ENL、NPM1/ALK、NPM/MLF1、MLL/ELL、MLL/AFX、MLL/AF1q、MLL/AF1p、PLZF/RARа等。由于白血病分型和预后分层复杂，因此没有千篇一律的治疗方法，需要结合细致的分型和预后分层制定治疗方案。目前主要有下列几类治疗方法：化学治疗﹑放射治疗﹑干细胞移植等。化学治疗是白血病重要的治疗手段之一。近年来新的化疗药物不断涌现，化疗方案不断更新，然而白血病总的完全缓解率和长期生存率仍然低下，究其原因，主要是白血病细胞对化疗药物的多药耐药。随着肿瘤分子生物学的发展，白血病的分子靶向治疗，日益成为临床医生首选治疗方式。然后，由于缺乏高灵敏度的基因突变检测和确诊技术，大多数白血病患者无法利用之相匹配的精准治疗方案，从而使患者错失了治疗的最优方案。80～90％急性白血病有克隆型染色体异常。我国白血病的诊断已经引入了WHO新分类的概念，这一新分类将具有特殊遗传学异常的白血病独立划分出来，而这些特殊的遗传学异常与FAB分型之间具有交叉性。以往的实际操作中，如果怀疑某些白血病患者涉及哪项融合基因，就进行这一项融合基因的检测。但是通常白血病临床进展很快，这种检测方法往往可能会导致选择错误，贻误病情。目前，靶向治疗方案越来越多，相应的靶向位点也在增加。因此，癌症基因突变检测对于癌症的个体化治疗具有重要的意义。目前常用的基因突变检测有测序法、PCR-SSCP、ARMS、数字PCR以及第二代高通量测序技术(NGS)等。其中测序法、PCR-SSCP、ARMS、数字PCR癌症基因检测技术，都只能提供几个基因的少数位点的突变信息。而利用第二代高通量测序技术，可以一次检测全部所需基因，获取基因全部的突变信息，有助于医生更准确制定治疗方案。本专利利用二代高通量测序技术检测白血病患者基因突变位点和发生融合的基因，有如下优势：缩短了检测所需时间，可以一次检测全部所需基因和融合基因，获取基因全部的突变信息，可以为更好治疗白血病提供更全面的诊断信息，有助于医生更准确制定治疗方案，减少白血病患者的痛苦。
技术实现思路
本专利技术提供一种准确度高、临床意义明确的白血病基因突变和基因融合的筛查方法。实现本专利技术目的的一种白血病基因突变和基因融合的筛查方法，包括如下步骤:(1)根据人类基因组HG19，调取白血病高频突变基因和融合基因的外显子和内含子序列。常见白血病基因列表如下：ABLATMASXL1BCL2BCL6BCORBIRC3BRAFCARD11CBLCBL-BCCND1CDKN2ACEBPACREBBPCSF3RDNMT3AEP300ETV6EZH2FBXW7FLT3FOXO1GNA13GATA1GATA2HRASIDH1IDH2ID3IL7RJAK1JAK2JAK3IKZF1KDM6AKITKRASMEF2BMLLMLL2MPLMYCMYD88NOTCH1NOTCH2NPM1NRASPAX5PHF6PRDM1PTENPTPN11RAD21RUNX1SETBP1SF3B1SMC1ASMC3SOCS1SRSF2STAG2STAT3SUZ12TCF3TET2TNFAIP3TNFRSF14TP53U2AF1WT1ZRSR2调取外显子的序列包含列表基因的基因区域，以及己知各个转录本的启动子和内含子区域；(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小60bp；(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应和转录的方法扩增出大量的带有生物素标记的探针，并制作白血病基因高通量检测试剂盒；所述试剂盒检测方法包括如下步骤:从患者血液中提取3-5ug基因组DNA，然后利用白血病常见基因探针将目的基因序列捕获出来，再用测序仪(IlluminaNextseq500)进行高通量测序，进而分析，找出与肺癌相关基因的所有突变信息，从而得到患者肺癌的变异情况，以达到准确基因诊断的目的。利用测序仪(IlluminaNextseq500)进行高通量测序，分析的过程包括单核苷酸多态性分析(SNP分析)过程、插入缺失标记分析(InDel分析)、基因融合和大片段扩增缺失分析流程；所述单核苷酸多态性分析(SNP分析)过程包括如下步骤:(1)测序仪(IlluminaNextseq500)获取原始短序列并去除测序数据中的接头；(2)用TrimGalore进行QC并去除低质量数据；(3)把短序列用BWA-Burrows-WheelerAlignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数:bwaaln-L-l40-i10-k2-t7-e40-M3-f)；(4)用GATK软件找出序列中所含有的单核苷酸多态性(SNP)的信息；(5)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等，过滤低质量值(大于25)和低覆盖度(大于10)的单核苷酸；(6)利用ANNOVAR3、人类基因组数据库(HOMO_SAPIENS_NCBI_B本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于白血病基因突变和基因融合的高通量测序检测方法，包括白血病高频突变基因和融合基因高通量测序检测方法；白血病高频突变基因和融合基因高通量测序的方法包括如下步骤：(1)根据人类基因组HG19，调取白血病高频突变基因和融合基因的外显子和内含子序列；常见白血病基因列表如下：

【技术特征摘要】
1.一种用于白血病基因突变和基因融合的高通量测序检测方法，包括白血病高频突变基因和融合基因高通量测序检测方法；白血病高频突变基因和融合基因高通量测序的方法包括如下步骤：(1)根据人类基因组HG19，调取白血病高频突变基因和融合基因的外显子和内含子序列；常见白血病基因列表如下：调取外显子的序列包含列表基因的基因区域，以及己知各个转录本的启动子和内含子区域;(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小60bp;(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应和转录的方法扩增出大量的带有生物素标记的探针，并制作白血病驱动基因捕获试剂盒;所述试剂盒筛查方法包括如下步骤:从病人血液中提取1-3ugDNA，然后利用白血病常见驱动基因探针将目的基因序列捕获出来，再用测序仪(IlluminaNextseq500)进行高通量测序，进而分析，找出与白血病相关驱动基因的所有突变信息，从而得到患者白血病的变异情况，以达到准确基因诊断的目的。2.根据权利要求1所述的一种白血病驱动基因的检测方法，其特征在于：采用测序仪进行高通量测序，分析的过程包括单核苷酸多态性分析过程、所述括入缺失标记分析流程、大片段扩增确实分析流程和基因融合分析流程;所述单核苷酸多态性分析过程包括如下步骤:(1)测序仪获取原始短序列;(2)去除测序数据中的接头和低质量数据;(3)把短序列定位到人类基因组数据相应的位置上;(4)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等;(5)过滤低质量值和低覆盖度的单核苷酸;(6)利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对单核苷酸进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核苷酸功能、SIFT预测单核苷酸影响蛋白功能预测;(7)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的单核苷酸作为候选的单核苷酸，在候选的单核苷酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的单核苷酸，同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的单核苷酸作为最后疾病相关的候选...

【专利技术属性】
技术研发人员：张道允，巩子英，叶建伟，王伟，
申请(专利权)人：嘉兴允英医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33