【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物分析，涉及一种抗体药物偶联物的偶联位点分析的方法。
技术介绍
1、抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate，adc)是一类通过化学连接子(linker)将具有强细胞毒性的小分子毒素(payload)与高度靶向的单克隆抗体相结合的新型生物药物。近年来，adc已在癌症治疗领域展现出显著优于传统化疗的临床收益风险比，并因此受到了广泛关注。adc的生产制备通常基于特定化学反应机理，将小分子毒素特异性地与抗体蛋白表面氨基酸残基进行偶联反应，小分子毒素分布于各个偶联位点，所得的adc产品是一种含有不同数量毒素的蛋白质混合物。抗体蛋白质具有致密的三维结构，不同区域的氨基酸的溶液可及性存在差异。这导致偶联在不同位点的小分子连接子-毒素(linker-payload，lp)会表现出不同的毒素释放速率，从而影响adc的药物代谢动力学和脱靶毒性。因此，对于adc偶联位点的确认和批次间定量比较对于确保药物质量以及产品批次间一致性具有重要意义。
2、偶联位点分析在adc药物的结构表征分析中应用范围广泛，包括但不限于在偶联反应的开发和优化过程中对特定位点的偶联率进行监测；通过鉴定所有存在的偶联位点，在工艺开发过程中确保偶联副产物被顺利排除；以及在可比性研究中，确保adc产品不同批次间各位点偶联率可比，从而保障产品质量在不同批次的生产过程中保持稳定。基于液相色谱-质谱联用(lc-ms)的肽图分析法是工业界主流的大分子药物一级结构表征手段，也是业界分析adc偶联位点的标准方法(anal.chim.acta.9
3、然而，目前传统肽图方法在定性地鉴别偶联位点和定量地测量偶联率方面仍然面临巨大挑战。首先，adc的小分子连接子-毒素lp的结构通常需要被设计为能在体内特定区域(如癌细胞区域)触发毒素分子的释放，并发挥毒素payload应有的作用机制(如dna拓扑异构酶抑制剂、微管抑制剂等)，因此lp通常具有相对一般氨基酸翻译后修饰(post-translational modification,ptm)更加庞大、复杂且疏水(亲脂性为小分子成药关键因素)的小分子结构。在质谱内碰撞能量的影响下，lp容易裂解成多种具有不同复杂结构的碎片，这使得识别关键肽段碎片并确认lp所连接的氨基酸偶联位点变得非常困难。此时对于关键离子的判断往往要引入大量的人工检索和判断，并且通常需要反复优化碰撞能量以获得质量足够高的二级谱图，以便在大量小分子lp碎裂产生的干扰性碎片中寻找相对信号较低的关键肽段骨架碎片；对于工业界主流运用的高通量肽图分析软件而言，通过软件预设参数进行数据分析来完成这一过程几乎变为不可能，这也对工业界数据分析自动化流程产生了一道障碍。其次，由于偶联率的计算基于偶联lp的肽段与该肽段的所有形式(含偶联和未偶联)的提取离子流色谱图(eic)峰面积之比，而高疏水性的lp结构会导致偶联肽段与未偶联肽段之间的质谱离子化效率存在较大差异，因此使用传统肽图方法进行特定位点偶联率计算时可能出现较大的定量偏差。另外，在传统肽图方法中，通常为了还原或烷基化试剂发挥最佳效果，可能会引入56℃或以上的温度进行孵育，并且可能使用ph≥8.0的缓冲溶液以便于蛋白酶试剂保持高活。但这些高温或弱碱性条件都容易造成adc连接子中常见的琥珀酸亚胺结构的开环水解，不利于对样品连接子的原始状态的检测和对后续结构变化的追踪监控。
4、因此，为了在adc早期研究、工艺开发、和临床阶段更便捷地为结构表征和生产质量监测提供分析支持，有必要开发通用、便利且可靠的测试方法，以应对疏水性lp对偶联位点鉴定和偶联率定量带来的挑战。此外，还需对样品制备中所用的物理条件进行优化，防止在样品处理时引入额外的结构变化，避免影响对样品质量相关属性初始状态的分析检测。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种抗体药物偶联物的偶联位点分析的方法。本专利技术所述方法能够解决adc产品在早期研究、工艺开发和临床阶段在偶联位点分析方面存在的偶联位点鉴定困难和偶联率定量不准的问题。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、一方面，本专利技术提供一种抗体药物偶联物的偶联位点分析的方法，所述方法包括以下步骤：
4、(1)利用木瓜蛋白酶在激活剂l-半胱氨酸的作用下对抗体药物偶联物进行酶解，释放出小分子毒素，将抗体药物偶联物中原本的化学连接子-小分子毒素结构转化为化学连接子残基；
5、(2)步骤(1)得到的含有化学连接子残基的样品在盐酸胍和三(羧乙基)膦还原剂存在下进行变性和还原，而后加入烷基化试剂进行烷基化；
6、(3)利用重组赖氨酸蛋白酶对步骤(2)得到的产物进行酶解，得到酶切后的肽段样品；
7、(4)对步骤(3)得到的酶切后的肽段样品进行数据采集，完成对抗体药物偶联物的如下至少一个目标的分析或测定：小分子毒素偶联位点的鉴定、对偶联水平的测定或对多种生物药产品质量属性的监测。
8、在本专利技术中，所述小分子毒素偶联位点鉴定具体包括以下步骤：
9、(i)在数据分析软件中设定化学连接子-小分子毒素的分子量和可能发生偶联的氨基酸位点，使用数据分析软件基于抗体药物偶联物的蛋白氨基酸序列进行数据库搜索；
10、(ii)数据分析软件进行搜库比对后，初步自动生成偶联位点的判断结果；
11、(iii)结合质谱的二级碎片数据进行人工验证，确认数据分析软件对偶联有氨基酸的关键离子碎片进行了正确的信息匹配，从而确认数据分析软件判断的偶联位点信息正确。
12、在本专利技术中，所述对偶联水平的测定具体包括以下步骤：
13、(i)在数据分析软件中设定化学连接子-小分子毒素和烷基化试剂的分子量，以及可能发生偶联和烷基化的氨基酸位点，使用软件基于抗体药物偶联物的蛋白氨基酸序列进行数据库搜索；
14、(ii)数据分析软件进行搜库比对后，自动生成软件判断出的偶联有化学连接子-小分子毒素的肽段列表，同时也会判断出相应的未偶联小分子毒素的肽段；
15、(iii)人工判断软件选出的偶联肽段是否准确，再验证软件中对质谱一级谱图中峰面积积分范围是否准确；
16、(iv)结合小分子毒素偶联位点鉴定的结果，并使用下述公式进行肽段的偶联水平计算：
17、
18、其中i位点表示小分子毒素偶联位点鉴定得到的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗体药物偶联物的偶联位点分析的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小分子毒素偶联位点鉴定具体包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对偶联水平的测定具体包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对质量属性的监测具体包括以下步骤：
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述数据分析软件为Byos数据分析软件、MASCOT数据分析软件或BioPharma Finder数据分析软件；
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，当抗体药物偶联物的目标药物/抗体比率DAR小于等于5，步骤(1)所述木瓜蛋白酶的使用量与抗体药物偶联物中抗体的重量比为1:500至1:333；
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述盐酸胍在反应体系中的终浓度为4.3-6.5M；
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(2)所述烷基化完成后，需要使用超滤
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述酶解为针对40μg步骤(2)得到的产物，加入1-2μg重组赖氨酸蛋白酶(Lys-C)，于37℃孵育0.5-1.0小时，之后使用50mM pH为7.5的Tris-HCl缓冲溶液将样品稀释到100μL，再重新加入2μg Lys-C酶解3-4小时；
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述数据采集利用超高效液相色谱质谱联用仪进行；
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述数据采集时，基于Thermo/Orbitrap Exploris 480/QE+质谱仪在正离子模式下进行质谱数据采集，仪器质核比扫描范围设置为250-2000m/z，离子源电喷雾电离源电压为4kV，二级碎裂模式使用高能碰撞解离，以3秒时间作为一个循环进行数据依赖型采集。
...【技术特征摘要】
1.一种抗体药物偶联物的偶联位点分析的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小分子毒素偶联位点鉴定具体包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对偶联水平的测定具体包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对质量属性的监测具体包括以下步骤：
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述数据分析软件为byos数据分析软件、mascot数据分析软件或biopharma finder数据分析软件；
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，当抗体药物偶联物的目标药物/抗体比率dar小于等于5，步骤(1)所述木瓜蛋白酶的使用量与抗体药物偶联物中抗体的重量比为1:500至1:333；
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述盐酸胍在反应体系中的终浓度为4.3-6.5m；
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(2)...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄子傲，周墨吟，王汝鑫，郭龙云，汪彤丹，黄晋萃，
申请(专利权)人：上海药明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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