用于核酸配对末端测序的方法、组合物、系统、仪器和试剂盒技术方案

在一些实施方案中，本教导提供用于配对末端测序的方法。在一些实施方案中，待经历配对末端测序的多核苷酸模板包含至少一个交联部分和至少一个易切断部分。在一些实施方案中，配对末端测序反应包括(a)正向测序步骤，(b)切割步骤，和(c)反向测序步骤。在一些实施方案中，配对末端测序反应包括(a)正向测序步骤，(b)交联步骤，(c)切割步骤，和(d)反向测序步骤。

Methods, compositions, systems, instruments, and kits for nucleic acid pairing end sequencing

In some implementation schemes, the present instruction provides a method for mating terminal sequencing. In some implementation schemes, the polynucleotide templates to be sequenced at the paired end sequence include at least one cross linking part and at least one easily cut part. In some implementation schemes, the paired end sequencing reactions include (a) forward sequencing steps, (b) cutting steps, and (c) reverse sequencing steps. In some implementation schemes, paired terminal sequencing reactions include (a) forward sequencing steps, (b) cross linking steps, (c) cutting steps, and (d) reverse sequencing steps.

【技术实现步骤摘要】
用于核酸配对末端测序的方法、组合物、系统、仪器和试剂盒本申请是申请日为2013年3月14日、专利技术名称为“用于核酸配对末端测序的方法、组合物、系统、仪器和试剂盒”的中国专利技术专利申请No.201380049832.6的分案申请。本申请在35U.S.C.§119下要求于2012年8月24日提交的美国临时申请号61/692,830的优先权利益，并且本申请是(1)2011年12月16日提交的美国申请系列号13/328,844的部分继续申请，所述美国申请要求美国临时申请号61/424,599(提交日2010年12月17日)；61/445,324(提交日2011年2月22日)；61/451,919(提交日2011年3月11日)；61/526,478(提交日2011年8月23日)；和61/552,660(提交日2011年10月28日)的优先权；并且还是(2)2011年12月16日提交的国际PCT申请号PCT/US2011/65535的部分继续申请，所述PCT申请要求美国临时申请号61/424,599(提交日2010年12月17日)；61/445,324(提交日2011年2月22日)；61/451,919(提交日2011年3月11日)；61/526,478(提交日2011年8月23日)；和61/552,660(提交日2011年10月28日)的优先权；将所有上述申请的公开内容通过引用整体并入本文。在整个本申请中，参考了多种出版物、专利和/或专利申请。这些出版物、专利和/或专利申请的公开内容在此处通过引用整体并入本申请中以更完整地描述本专利技术所属领域的状况。
技术介绍
核酸扩增在分子生物学中是非常有用的，且在生物学、治疗、诊断、法医学和研究的几乎每个方面中具有广泛的适用性。通常，使用一种或多种引物从起始模板制备多个扩增子，其中所述扩增子与用于制备它们的模板是同源的或互补的。多路扩增还可以使过程流线化，并减少开销。可以将单组引物与不同的模板相混合，或者可以使单一模板与多种不同的引物接触，或者可以使多种不同的模板与多种不同的引物接触。本申请涉及用于核酸扩增和/或分析的方法和试剂。
技术实现思路
本文提供了核酸扩增和/或分析的方法、试剂和产品。扩增可以使用固定化的和/或可溶性的引物。从本文提供的方法制备的扩增子是适合用于其它分析(例如，序列测定)的底物。附图说明图1：显示模板步移(templatewalking)的一个实施方案的示意图。在一个替代实施方案中，固定化的引物包含被命名为(A)n的富含腺苷的序列，例如，(A)30(SEQIDNO:1)，且固定化的引物在模板上的引物结合位点包含互补的富含T的序列，例如，(T)30(SEQIDNO:2)。图2：通过模板步移在珠子上进行扩增、以及在平面阵列上沉积珠子进行测序的概述。图3：使用基于半导体的合成测序检测的替代实施方案。可以使用模板步移在珠子上或在反应室的基底或底部上制备克隆扩增子群体。在一个替代实施方案中，固定化的引物包含被命名为(A)n的富含腺苷的序列，例如(A)30(SEQIDNO:1)，且固定化的引物在模板上的引物结合位点包含互补的富含T的序列，例如(T)30(SEQIDNO:2)。图4：在平面衬底上的引物坪(primerlawn)形式的固定化位点的替代实施方案。可以使用分离的固定化位点的阵列，或者可以将引物的单个连续坪(lawn)视作固定化位点的随机阵列。任选地，在引物的连续坪中的一个或多个固定化位点的位置可以是尚未确定的，其中所述位置在初始模板步移之前在连接时确定，或者通过扩增簇占据的空间来确定。在一个替代实施方案中，固定化的引物包含被命名为(A)n的富含腺苷的序列，例如，(A)30(SEQIDNO:1)，且固定化的引物在模板上的引物结合位点包含互补的富含T的序列，例如，(T)30(SEQIDNO:2)。图5：温度对模板步移反应的影响。计算在模板步移扩增之前和之后的δCt，并相对于反应温度绘制其图形。图6：96双链体TaqManqPCR反应的Ct值的表。图7：通过模板步移在珠子上的100,000倍扩增。计算在模板步移反应之前和之后的δCt、以及在模板步移反应之前和之后的扩增倍数，并相对于反应时间绘图。图8：一个示例性的链倒转(strand-flipping)和步移策略的示意描绘。(A)模板步移，(B)链倒转以产生倒转链，(C)新引物结合序列Pg'在最终的倒转链上的添加。图8A-C公开的“(A)30”、“(T)30”、“(T)20”和“(T)32”分别是SEQIDNO:1-3和22。图9：配对末端测序方法的非限制性图示。定义任何主动动词(或它的动名词)意图指示，对应的动作以特定的、显著的或实质的水平(例如，超过随机的、或超过适当的对照)发生。例如，“杂交”的动作指示，发生显著或实质水平的特异性杂交。例如，在扩增过程中引物与模板杂交的情况下，杂交任选地足以从单个模板实现期望的扩增倍数–例如，至少103或104或105或106个扩增子。在另一个实施例中，特异性杂交超过不具有显著量的序列同源性的2个核酸之间发生的杂交。在另一个实施例中，特异性杂交包括：在确定的严谨性条件下，在不发生与杂交混合物中存在的其它核苷酸序列的实质结合下，核酸与靶核苷酸序列的结合。任选地，所述样品源自为了诊断或法医学目的取自活的或死的生物体(例如，人类)的组织或流体。任选地，所述样品包含基因组文库或外显子组文库。在下述情况下，可以认为2个序列是互补的：在选择的条件下，一个序列与另一个序列实质性地且特异性地杂交。在下述情况下，可以认为2个序列是同源的：在选择的条件下，一个序列的反向补体可以与另一个序列实质性地且特异性地杂交。实质性杂交是例如这样的情况：所述核酸之一中的超过5％(任选地10％、30％、50％或80％)与另一个核酸杂交。2个单链核酸之间的杂交经常、但不一定涉及在选择的条件下稳定的双链结构的形成。选择的条件是例如这样的条件：在该条件下预期会杂交，例如，在扩增循环的退火步骤中。在下述情况下，2个单链多核苷酸被任选地视作杂交：它们通过2个或更多个顺序地邻近的碱基配对而彼此键合。任选地，在双链结构的一条链中的大部分核苷酸与在另一条链上的核苷发生Watson-Crick碱基配对。杂交也包括核苷类似物(诸如脱氧肌苷)、核苷与2-氨基嘌呤碱基等的配对，其可以用于减少探针的简并性，不论这样的配对是否涉及氢键的形成。在下述情况下，可以认为核酸被固定化：至少在选择的条件下(例如，在扩增反应过程中)，其以基本上稳定的方式与载体连接。所述连接可以是通过任何机理，包括、但不限于非共价键合、离子相互作用、共价键。如果第一核酸与固定化在载体上的第二核酸杂交，那么所述第一核酸也可以视作在扩增过程中被固定化在载体上，只要扩增条件使得大量第一核酸和第二核酸在扩增过程中的任意时间或所有时间彼此结合或连接。例如，第一核酸和第二核酸可以通过包含Watson-Crick碱基配对或氢键合的杂交结合到一起。在一个实施例中，选择的扩增条件允许至少50％、80％、90％、95％或99％的第一核酸保持与第二核酸杂交，或反之亦然。如果核酸未与载体直接地或间接地连接或结合，可以认为核酸是未固定化的或非固定化的。在下述情况下，可以认为介质在选择的条件下本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于配对末端测序的方法，其包括：(a)在附着至表面并且具有至少一个可切割的易切断部分的模板多核苷酸上进行正向测序反应，所述正向测序反应通过(i)将第一引物杂交至所述模板多核苷酸，(ii)通过利用聚合酶催化的连续核苷酸掺入进行引物延伸反应来延伸所述第一引物并形成杂交至所述模板多核苷酸的第一延伸链，和(iii)鉴定所述第一延伸链中所掺入的核苷酸来进行；(b)通过将所述易切断部分与热、辐照、至少一种化学品或至少一种酶进行反应来切割所述模板多核苷酸，以形成截短截短的模板多核苷酸并任选地形成末端3’磷酸基团，和任选地将所述末端3’磷酸基团转化成‑OH基团，和任选地去除被切割的模板多核苷酸的部分；和(c)在所述第一延伸链上进行反向测序反应，所述反向测序反应通过利用使用聚合酶催化的连续核苷酸掺入的引物延伸反应来延伸所述截短截短的模板多核苷酸上的末端3’OH基团并形成第二延伸链，和(iii)鉴定所述第二延伸链中所掺入的核苷酸来进行。

【技术特征摘要】
2012.08.24 US 61/692,8301.用于配对末端测序的方法，其包括：(a)在附着至表面并且具有至少一个可切割的易切断部分的模板多核苷酸上进行正向测序反应，所述正向测序反应通过(i)将第一引物杂交至所述模板多核苷酸，(ii)通过利用聚合酶催化的连续核苷酸掺入进行引物延伸反应来延伸所述第一引物并形成杂交至所述模板多核苷酸的第一延伸链，和(iii)鉴定所述第一延伸链中所掺入的核苷酸来进行；(b)通过将所述易切断部分与热、辐照、至少一种化学品或至少一种酶进行反应来切割所述模板多核苷酸，以形成截短截短的模板多核苷酸并任选地形成末端3’磷酸基团，和任选地将所述末端3’磷酸基团转化成-OH基团，和任选地去除被切割的模板多核苷酸的部分；和(c)在所述第一延伸链上进行反向测序反应，所述反向测序反应通过利用使用聚合酶催化的连续核苷酸掺入的引物延伸反应来延伸所述截短截短的模板多核苷酸上的末端3’OH基团并形成第二延伸链，和(iii)鉴定所述第二延伸链中所掺入的核苷酸来进行。2.权利要求1的方法，其中所述模板多核苷酸的5’末端附着至表面。3.权利要求1的方法，其中所述模板多核苷酸还包含交联部分。4.权利要求3的方法，其中所述交联部分包括3-氰乙烯基咔唑核苷。5.权利要求1的方法，其中所述可切割的易切断部分包括尿嘧啶碱基。6.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·李，K·Q·劳，J·奥尼尔，J·孔克尔，K·黑利，R·卡辛斯卡斯，Z·马，P·布若斯卡，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US